Tuberculose en malaria zijn twee van de meest voorkomende infecties bij mensen en de belangrijkste oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Wij vestigden een experimenteel model systeem om resultaten van malaria-tuberculose co-infectie te bestuderen in muizen na challenge met beide ziekteverwekkers via hun natuurlijke route van infectie.
Co-infecties van nature door de geografische overlapping van verschillende soorten pathogene organismen. Gelijktijdige infecties waarschijnlijk moduleren de respectieve immuunrespons op elke afzonderlijke pathogeen en kunnen daardoor pathogenese en ziekte uitkomst beïnvloeden. Coinfected patiënten kunnen ook verschillend reageert op anti-infectieuze interventies. Coinfection tussen tuberculose veroorzaakt door mycobacteriën en de malariaparasiet Plasmodium, die beide zijn coendemic in vele delen van Afrika bezuiden de Sahara, is niet in detail bestudeerd. Met het oog op de uitdagende, maar wetenschappelijk en klinisch zeer relevante vraag hoe malaria-tuberculose co-infectie moduleren gastheer immuniteit en het verloop van elke ziekte, hebben we een experimenteel muismodel dat ons toelaat om de opgewekte immuunrespons op beide ziekteverwekkers ontleden in de coinfected gastheer benaderen . Van de nota, om zo precies na te bootsen natuurlijk verworven menselijke besmettingen, voeren we experimenteelinfecties van muizen met beide ziekteverwekkers door hun natuurlijke routes van infectie, dwz spuitbussen en muggen bijten, respectievelijk.
Bevolkingsgroepen worden zelden blootgesteld aan slechts een pathogeen. Met name in gebieden met een hoge incidentie van infecties zoals sub-Sahara Afrika, co-infecties vormen een eerste, maar zeer ondergewaardeerd probleem voor de volksgezondheid. Tuberculose en malaria zijn de meest voorkomende bacteriële en parasitaire infecties in mensen, respectievelijk blijven belangrijke oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in arme bevolking in de tropen. Ondanks de brede geografische overlap tussen tuberculose en malaria en het groot aantal personen met een risico op co-infecties, zeer weinig bekend over de interacties tussen de verschillende en vaak tegengaan immuun regulatoren en effectoren gelijktijdig opgewekt tegen malaria parasieten en tuberkelbacteriën in coinfected individuen.
Knaagdier modellen van gemengde infecties laten karakteriseren differentieel immuunreacties tegen verschillende ziekteverwekkers in een gastheer, waardoor licht vergieten op de wederzijdse invloedlen moduleren pathologie en klinische verloop van de afzonderlijke ziekte, waardoor er ook nieuwe aanbevelingen voor therapie en preventie identificeren. We hebben een experimenteel muismodel die ons in staat stelt om de gevolgen veroorzaakt door een gelijktijdige infectie met Mycobacterium tuberculosis (MTB) en knaagdieren Plasmodium soorten binnen dezelfde host 1 onderzoeken vastgesteld. Belangrijk is natuurlijk verworven humane infecties zo goed mogelijk emuleren ons model voert de natuurlijke routes van infectie door beide pathogenen. Tuberculose is een lucht infectie, die dus vooral manifesteert in de longen. De verwekker, Mtb wordt door mensen met een actieve ziekte via de aerosol route verzonden als ze verdrijven besmettelijke aërosoldruppeltjes tijdens het hoesten of niezen. Aldus aerosol infectie is het mogelijk om deze natuurlijke infectie na te bootsen. Generatie van de deeltjes die Mtb bevatten, kunnen worden bereikt door het gebruikvan een inhalatie-belichtingssysteem. Deze hele lichaam blootstelling kamer kan blootstellen proefdieren Mtb-bevattende infectieuze aërosoldruppeltjes (figuur 1) die ingeademd in de alveoli van de longen, waar infectie geïnitieerd 2.
Malaria aan de andere kant is een vector overgedragen ziekte veroorzaakt door de protozoaire, apicomplexa parasiet Plasmodium die van nature wordt overgebracht door de beet van een vrouwelijke Anophelinen mug. Tijdens de bloedmeel, zijn besmettelijk sporozoïeten gedeponeerd onder de huid gastheer en vervolgens de lever bereiken via de bloedbaan. Binnen hepatocyten zij ontwikkelen en zich snel vermenigvuldigen in lever-fase schizonten. Uiteindelijk volwassen schizonten scheuren en loslaten duizenden pathogene eerste generatie merozoites in de bloedstroom waar begint een geleidelijke cyclus van rode celinvasie, replicatie, rode bloedcellen scheuren en reinvasion 3. De Plasmodium levenscyclus Continwaarden zoals sommige merozoïeten ontwikkelen tot seksueel parasietstadia, de mannelijke en vrouwelijke gameten die door muggen worden genomen tijdens bloedmaaltijd. In de mug, Plasmodium sporozoïeten ontwikkelen binnen oöcysten die woonachtig zijn in de mug middendarm en uiteindelijk migreren naar de speekselklieren, die ze doorstuurt naar een andere host 3,4.
Terwijl in experimentele diermodellen de levering van Mtb via de aerosol en dus meest relevante route is heel gebruikelijk, veel experimentele knaagdieren Plasmodium infectie studies met inbegrip van studies naar malaria-tuberculose co-infectie 5-7 zijn uitgevoerd door het infecteren van muizen met geparasiteerde erytrocyten, die aanleiding uitgevoerd om bloed-stadium malaria-infectie met uitsluiting van de klinisch-stille lever-fase-fase. Echter, de lever fase is een verplichte stap tijdens de infectie en die relevant zijn voor anti-plasmodial immuniteit 8-11. Wij vinden het daarom belangrijk om de lever ph omvattenase van malaria transmissie en onderhoud in studies van zowel malaria en malaria-tuberculose co-infectie, respectievelijk. Bovendien is aangetoond dat van nature overgedragen sporozoieten zijn besmettelijk dan die via de naald 12 infecties, die ons gevraagd de malaria-infectie vast aan muggenbeet plaats van injecteren geïsoleerde speekselklier afgeleid sporozoieten. De enige manier om besmettelijke muggen voor natuurlijke transmissie van malaria parasieten te verkrijgen is om de hele levenscyclus van de parasiet in zowel de gewervelde gastheer (hier muis) en de mug vector handhaven. De toegang tot een insectary voor parasiet onderhoud onvermijdelijk is om de natuurlijke verzending uit te voeren door de beet.
Ons protocol hierin beschreven is ontwikkeld om te onderzoeken hoe de co-infectie met Plasmodium sporozoïeten effecten op chronische tuberculose 1. Om dit te doen, zijn muizen aerosol besmet met M. tuberculose en 40 dagen later, toen M. tuberculose-infectie heeft de chronische fase bereikt, muizen worden blootgesteld aan malaria-besmettelijke muggen. Het resultaat van zowel malaria en tuberculose in het coinfected dieren kunnen worden gevolgd door monitoring bloed parasitemia en bacteriële verontreiniging in weefsel, respectievelijk. In ons protocol, zullen we in detail hoe muizen te infecteren met beide ziekteverwekkers beschrijven via hun natuurlijke infectie route en hoe succesvol ziekteverwekkertransmissie bevestigen. In onze handen, het gewoonlijk bereikt besmettingsgraad voor zowel experimentele infecties is 100%. Deze protocollen kunnen worden toegepast op zowel afzonderlijk of infecties, zoals wij, modelleren en bestuderen coinfection tussen twee van de meest uitdagende menselijke infectieziekten bestuderen. Dit model is van toepassing op andere Mycobacterium en knaagdieren Plasmodium soorten dan die in dit protocol beschreven.
We beschreven hoe muizen productief kan worden besmet met Mtb en P. berghei via hun natuurlijke routes van infectie. We passen gevestigde infectie protocollen experimentele tuberculose of malaria 13 12 bestuderen en onlangs hen genomen maatregelen om coinfection tussen Mtb en Plasmodium studeren in het muismodel 1.
De meest kritische stappen voor een succesvolle infectie is de transmissie van zowel pathogenen in de gewenste cijfers. Mycobacteriële voorraden mag niet ouder dan 2 jaar, omdat ze levensvatbaarheid zullen na verloop van tijd, en de oorspronkelijk vastgestelde titer van de voorraden zal waarschijnlijk niet meer accuraat zijn. Daardoor zou infectie doses veel lager dan verwacht. Daarom moet CFU titers van stamculturen om de paar maanden worden bepaald. Even belangrijk is de gestandaardiseerde teelt en productie van Mtb voorraden in de eerste plaats. Kweekomstandigheden zoalsmedium, supplementen, tijd en volume moeten worden gestandaardiseerd om te kunnen vergelijken van gegevens uit experimenten met verschillende aandelen van Mtb. Mycobacteriën neiging om klonteren in cultuur, daarom is het belangrijk om kweekomstandigheden houden gestandaardiseerd, oogst bacteriën gelijktijdig groeifase en resuspendeer vaak tijdens aliquoteren. Anders is er een grote variatie in CFU titers en infectie uitkomst kan zijn.
De generatie van homogeen besmette muggen batches is een cruciale stap. Aangezien verschillende muggen voeden elke individuele muis, is het belangrijk dat alle muggen gebruikt voor een infectie experiment uit dezelfde batch en dat uitsluitend partijen waar meer dan 90% muggen besmet worden gebruikt.
Het huidige model kan worden gebruikt om immuunreacties en modulaties in coinfected gastheer ontleden door te vergelijken met de immuunresponsen bij enkele geïnfecteerde gastheren. We kunnen toepassen various gevestigde methodologieën zoals histologie, immunohistochemie, cytometrie analyse van immuuncelpopulaties of PCR en ELISA voor cytokine en chemokine detectie om het weefsel of lichaamsvloeistoffen plaats. Opgemerkt zij, dat deze muismodellen hebben bepaalde beperkingen. Overwegende dat de meerderheid van de mensen die besmet zijn met Mtb ontwikkelen van een latente infectie met geen tekenen van klinische symptomen, muizen ontwikkelen een chronische ziekte met progressieve longpathologie. Toch C57BL / 6 muizen zijn relatief goed bestand tegen Mtb infectie en niet ontwikkelen klassieke granulomen zoals waargenomen in tuberculosepatiënten mens. Hierdoor immunopathologische reacties in de muis weerspiegelen niet latent of actieve menselijke tuberculoseziekte behoren. Ondanks de discrepantie tussen latente en chronische ziekten bij de mens en de muis, zijn muizen uitgebreid gebruikt om gastheer factoren die Mtb-infectie onder controle en zijn waardevolle en onmisbare hulpmiddelen te onderzoeken identificeren en te bestuderenimmuunresponsen bij infectieziekten. Belangrijk gevoeligheid voor Mtb infectie varieert aanzienlijk gebruikte inteelt muizenstammen en gevoelige stammen DBA of C3H kunnen in co-en single-infectie studies. Verder kunnen naast de pathogene species hierin beschreven andere Mycobacterium species plaats (bijvoorbeeld klinische isolaten) worden gebruikt. Ook, terwijl er geen enkele malaria model repliceert alle aspecten van de ziekte bij de mens verschillende muismodellen hebben sterk lijken op de verschillende aspecten van natuurlijk verworven menselijke malaria-infectie. Bijvoorbeeld, P. berghei ANKA en P. yoelii YM/17XL worden op grote schaal bestudeerd modellen van menselijke (P. falciparum-geïnduceerde) ernstige malaria, met P. berghei ANKA wordt beschouwd als een uitstekend model voor menselijke hersen malari s 14,15. P. berghei NK65 is een uitstekend model voor hyperparasitemie en acute malaria anemie, en is onlangsbeschreven als een experimenteel model voor malaria-gerelateerde acute respiratory distress syndrome (MA-ARDS 16). Met behulp van de beschreven coinfection model, konden we recent aantonen dat gelijktijdige P. berghei NK65 infectie verergert chronische tuberculose 1.
Naast het gebruik van verschillende knaagdieren malariaparasieten, kan de volgorde en timing van infectie gebeurtenissen worden aangepast afhankelijk van de onderliggende vraagstelling. Ter plaatse kan gelijktijdige Plasmodium infecties zich op het moment van Mtb infectie of later verkregen zijn. In beide gevallen zal de immuunrespons op Mtb en Plasmodium kunnen anders worden beïnvloed. Daarom kunnen muizen worden geïnfecteerd met Plasmodium sporozoieten voor of na Mtb infectie. Bovendien kunnen muizen op verschillende tijdstippen worden aangevochten plaatsen Mtb infectie om de impact van de Plasmodium-geïnduceerde immuunrespons op acute versus chronische beoordelentuberculose. Belangrijk, bij het kiezen van een malariaparasiet voor het bestuderen van malaria-tuberculose co-infectie, moet men zich ervan bewust dat sommige knaagdier Plasmodium spanningen veroorzaken acute ziekte in bepaalde muizen en bezwijken voor infectie in slechts enkele dagen of weken, terwijl Mtb veroorzaakt chronische en bij immunocompetente langdurige infecties muizen. Vandaar, de timing van co-infecties is cruciaal om tot een vroegtijdige dood van proefdieren te vermijden.
De modulatie van de immuniteit van de gastheer door de gelijktijdige infectie met verschillende pathogenen soort blijft slecht begrepen. Onze experimentele coinfection model geeft een krachtig hulpmiddel om Mycobacterium onderzoeken – Plasmodium interactie met het immuunsysteem van een coinfected gastheer en zal bijdragen aan ons begrip hoe co-infecties kunnen beïnvloeden pathogenese, ziekte uitkomst, vaccinatie, immunodiagnostiek, en therapie.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Miriam Ester bedanken voor muggen. Dit werk werd ondersteund door eigen middelen van de Research Center Borstel en sloot de financiering door het Leibniz Center Infectie.
Buraton | Schülke | active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal) | |
Middlebrook 7H9 | Sigma | M0178 | For Mtb broth cultures |
Middlebrook 7H11 | BD Biosciences | 283810 | Agar medium for Mtb culture |
Middlebrook OADC enrichment medium | BD Biosciences | 212240 | Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture |
Staining Dish | Science Services | E62542-12 | |
24-Slide Holder w/Handle | Science Services | E62543-06 | |
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution | Merck Millipore | 109204 | |
Wright´s stain | Sigma | W0625 | |
Inhalation Exposure System | Glas-Col | ||
Nebulizer-Venturi | Glas-Col | ||
Ice cream cups | Häagen-Dazs | Used as mosquito cages | |
Metal-frame mosquito cages | BioQuip Products | 1450A |