Мы разработали анализ в пробирке, чтобы исследовать роль иммунорегуляторных путей в регуляции секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток.
Т-клеток истощение является основным фактором в неудачной возбудителя оформления во время хронических вирусных инфекций. Иммунорегуляторных пути, такие как PD-1 и IL-10, которые активируется после этого постоянного воздействия антигена и способствуют потере пролиферации, снижение цитолитического функции, и нарушение продукции цитокинов CD4 и CD8 Т-клеток. В мышиной модели инфекции LCMV, введение блокирующих антител против этих двух путей дополненной Т-клеточные реакции. Тем не менее, в настоящее время нет анализа в пробирке, чтобы измерить влияние такой блокады на секрецию цитокинов в клетках из образцов человека. Наш протокол и экспериментальный подход дает нам возможность точно и эффективно количественно восстановление продукции цитокинов по ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток из ВИЧ-инфицированных субъектов.
Здесь мы изображают экспериментальный дизайн в пробирке, который позволяет измерять секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток и их влияние на другой челл подмножеств. CD8 T-клетки истощались из цельной крови и остальные РВМС выделяли с помощью метода разделения Ficoll. CD8 обедненного РВМС затем инкубировали с блокирующие антитела против PD-L1 и / или IL-10Rα и, после стимуляции ВИЧ-1 Gag пула пептидов, клетки инкубировали при 37 ° С, 5% СО 2. После 48 часов, супернатант собирали для анализа цитокинов бисера массивы и клеточные осадки собирали для любого фенотипического анализа с помощью проточной цитометрии или транскрипционный анализ с использованием Qrt-PCR. Для более детального анализа, различные клеточные популяции были получены путем селективного истощения подмножества из МНПК или путем сортировки с использованием проточной цитометрии, прежде чем оценивать в тех же анализов. Эти методы обеспечивают высокую чувствительность и специфичность подход для определения модуляцию продукции цитокинов на антиген-специфических Т-хелперов и для определения функциональных взаимодействий между различными популяций иммунных клеток.
Во стойких вирусных инфекций, вирусов конкретных-Т-клетки приобретают функциональные дефекты в процессе, известном как Т-клеток истощения. В начале естественных условиях исследования в мышиной LCMV модели хроническим вирусным инфекции установлено, что измученные вирус-специфических Т-клеток сократили цитолитическую функцию против инфицированных вирусом клеток, теряют способность к пролиферации и сократили способность производить цитокины, такие как IL-2, TNF- α и ИФН-γ 1,2. Сложная сеть иммунорегуляторных путей, таких как PD-1 и IL-10, которые активируется во время хронических инфекций и способствуют T дисфункции клеток (обзор в 3,4). В естественных введения блокирующих антител против этих ингибирующих путей в LCMV мыши модель восстановлен функцию истощенных вирус-специфических Т-клеток и повышенную вирусной зазор, указывая, что истощение Т-клеток представляет собой частично обратимый феномен (обзор в 5).
Выводы по гоэ LCMV модель быстро распространяется на человека хронических вирусных инфекций, таких как ВГВ, ВГС и ВИЧ 5. При хроническом инфекции ВИЧ-1, ПД-1 и IL-10 Тропы активируется в инфицированных субъектов и коррелируют с параметрами прогрессирования заболевания, непосредственно с вирусной нагрузки и обратно с CD4, 6-8. Антитело блокада PD-1 или IL-10 пролиферации путей в пробирке восстановлен ВИЧ-специфических CD4 и CD8 Т-клеток, указывающих, что, подобно модели LCMV мыши, истощение Т-клеток у человека является частично обратимым явлением. Однако, в связи с деликатным характером экспериментов на образцах человека, а также ограничений в чувствительности анализов в лабораторных условиях, тщательного расследования функциональных профилей реставрационных достичь за счет этих мер поразительно отсутствует. Пролиферации анализы были, до сих пор, единственным надежным анализа в пробирке испытания в большинстве исследований, но есть замечательный отсутствие доказательств о влиянии этих Интерконвенций на: 1) убийство мощностью цитотоксических Т-клеток, 2) противовирусное действие Т-клеток на вирусную репликацию, 3) профиль секреции цитокинов и 4) воздействие на CD4 Т-клеток на других подмножеств клеток.
Внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) является очень полезным и широко используется проточной цитометрии на основе анализа, который используется для обнаружения продукцию цитокинов в клетках различных типов в обоих мышей и человека. Кроме того, было исследовано влияние антител блокады ингибирующих путей. В ICS анализов, секрецию цитокинов блокируется путем добавления брефельдин и / или монензин. Цитокины ловушке внутри клеток затем обнаружены с флуоресцентными антителами на полихроматическое проточной цитометрии. Продолжительность анализа обычно ограничивается 6 или 12 ч после антигенной стимуляции, так как оба брефелдин и Монензин, который обычно добавляют в течение 2 часов антиген того, являются токсичными к клеткам. ICS анализ является мощная техника, которая была полезна ян исследование влияния в естественных условиях введения блокировки вмешательства антител у мышей, где клетки были извлечены после определенного периода времени после воздействия антител 9. Тем не менее, есть несколько ограничений для применения этого экспериментального подхода для оценки влияния блокады ингибирующих рецепторов в образцах человека. При выполнении антител вмешательства ингибирующих путей в час стимуляции 6 или 12 в пробирке (обычно в случае с образцами человека), блокада ингибирующих рецепторы в большинстве случаев не изменяет частоту реагирования антиген-специфические Т-клетки, как измерить стандартными ICS анализов 6, 7. Измерения продукции в ячейке цитокинов по результатам теста средней или средней интенсивности флуоресценции дали противоречивые результаты 6, 7, 10. С другой стороны, когда ICS проводят при поздно момент времени после стимуляции (то есть шесть дней), изменения количества цитокинов, секретирующих слоктей можно наблюдать. Различия Совокупный эффект измененного пролиферации, выживания, и изменения в эффекторной функции, которые накапливаются в течение определенного периода времени 6. Один из способов частично преодолеть эти ограничения, чтобы инкубировать в течение более длительных периодов времени (например, 36 ч, 60 ч, и т.д..) С антигеном перед добавлением секреции цитокинов блокатор, не дожидаясь распространение произойти. Мы успешно использовали этот метод для определения кинетики секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 и CD8 Т-клеток 11,12, однако, такой подход не в состоянии обнаружить небольшие ответов и не даст комплексный результат общая секреция цитокинов происходит так стимуляции. Таким образом, ICS не достаточно чувствительный метод для обнаружения воздействия блокады ингибирующих путей на количество цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками по сравнению с мРНК цитокинов количественного измерения или секреции цитокинов в supernatanт в тех же точках времени. Кроме того, большинство из цитокинов, продуцируемых активированными Т-клетками действовать в аутокринного моды, внося вклад в положительный или отрицательный обратной связи через взаимодействие с антиген-представляющих клеток. Таким образом, добавление брефельдин или монензин в ICS тесте предотвращает секрецию цитокинов и, таким образом, стимуляция Т-клеток не является оптимальным. Наконец, обнаружение нескольких цитокинов с ICS ограничена доступностью и чувствительностью антител для детекции цитокинов с проточной цитометрии, а также из-за ограниченности в количестве флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно в любом данном панели.
Мы разработали высокочувствительный в пробирке экспериментальный подход для оценки воздействия иммунорегуляторных путей в регуляции секреции цитокинов ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток, а затем CD4 помощь антиген представляющих клеток (АПК) и естественных клеток-киллеров (NK-клетки). Этот метод также может быть использован для оценки ИТПМКТ блокады ингибирующих молекул на функции CD8 Т-клеток, разрушая лимфоциты CD4 от МНПК или путем стимулирования с оптимальными пептидов, которые признаны только CD8 Т-клеток. В отличие от внутриклеточного окрашивания цитокинов анализов, мы решили, чтобы не мешать секреции цитокинов ВИЧ-специфических Т-клеток CD4 для того, чтобы иметь возможность: 1) выполнить более точное количественное определение уровней цитокинов, производимых; 2) исследовать более широкий панель цитокинов или эффекторных молекул, и 3) оценить влияние цитокинов, произведенных ВИЧ-специфических CD4 Т-клеток на других подмножеств клеток. Мы стимулируют CD8 истощенных РВМС с ВИЧ-1 Gag пула пептидов в присутствии блокирующих антител для иммунорегуляторного пути интереса. По истечении заданного времени инкубации, обычно 48 часов, мы собираем супернатанты для измерения секрецию цитокинов с массивами бортовых и собирать ячейки гранул либо для фенотипического анализа различных подмножеств клеток или для транскрипции анализа. Следует отметить, что при Тего 48 раз час точка, мы не обнаружить значительное население пролиферирующих Т-клеток 12. Это гибкий подход и несколько адаптации этой конструкции могут быть применены для решения различных гипотез. Например, отдельные подмножества клеток (например, ВИЧ-специфических Т-клеток CD4 или PD-1 высоких CD4 Т-клеток и т.д.). Могут быть отсортированы после 12 ч инкубации до дальнейшей инкубации в течение 36 ч с последующим сбором и супернатантах клеточных осадков исследовать более конкретно воздействие мероприятий блокады на секрецию цитокинов, определенных субпопуляций МНПК.
Коллекция Супернатант является императивом частью этого эксперимента. При заготовке супернатантов для анализа Luminex аликвоты были сделаны и выдерживают при -80 ° С, чтобы предотвратить деградацию белков из-за циклов замерзания-оттаивания. Замораживания и оттаивания могут быть резкие п?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Гордона Фримена для обеспечения блокирующей антитела против PD-L1. Мы благодарим клиническое и лабораторное персонал на Массачусетского общего госпиталя и всех участников исследования за их неоценимую роль в этом проекте.
Работа выполнена при поддержке Национального института аллергии и инфекционных заболеваний Национального института здоровья (PO1 АИ-080192; ДЭК), Национальный легочное сердце и крови Института Национальных Институтов Здоровья (РВЫХ1 HL-092565; ДЭК). ДЭК поддерживается исследовательский Scholar Карьера премии Фонда исследований в области здравоохранения Квебека (FRQS). FP поддерживается стипендий гранта Massachusetts General Hospital Исполнительного комитета по научным исследованиям и Гарвардской Глобального института здравоохранения (HGHI).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+ | Sigma | H9394 | |
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
Human Serum AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30 001 CI | |
L-glutamine | Mediatech | 25 005 CI | |
HEPES buffer | Mediatech | 25060CI | |
FcR blocking reagent, human | Miltenyi | 130-059-901 | |
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail | Stem Cell | 15663 | |
LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | L23105 | |
Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Improm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
IFN-γ primer | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
GAPDH primer | Invitrogen | FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG |