Summary

培養およびメンテナンス<em>クロストリジウム·ディフィシル</em>嫌気性環境での

Published: September 14, 2013
doi:

Summary

クロストリジウム·ディフィシルは、厳密な嫌気性菌で、抗生物質関連下痢(AAD)を引き起こす病原性細菌である。ここで、単離培養し、Cを維持するための方法ディフィシル栄養細胞と芽胞が記載されている。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確実にするために定期的なメンテナンスを必要とする、嫌気性チャンバーを必要とディフィシル栽培。

Abstract

クロストリジウム·ディフィシルは、抗生物質関連下痢症(AAD)の主な原因であり、重要な院内感染病原体であるグラム陽性嫌気性、胞子形成細菌である。C.ディフィシルは隔離し、育成することで悪名高いことは困難であり、環境中の酸素でさえ低いレベルに非常に敏感である。ここでは、Cを単離する方法糞便サンプルからディフィシル 、その後培養すること長期保存用グリセロールストックの調製のためディフィシルが提示される。顕微鏡や動物実験を含む下流の様々なアプリケーションのために、実験室での胞子株を作製し、列挙するための手法についても説明します。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確保するための一貫性嫌気性環境を維持する嫌気性チャンバーを必要とするディフィシル成長。我々は、約なくチャンバの内外に物質を移送するためのプロトコルを提供する効率的かつ一貫したC.ための適切な嫌気性環境を維持するのに必要な定期的なメンテナンスのための提案と共に有意な酸素汚染を用いディフィシル栽培。

Introduction

クロストリジウム·ディフィシルは、絶対嫌気性菌と人間と動物の致命的な胃腸病原体であるグラム陽性、芽胞形成細菌である。最初は新生児1、Cから糞便中に見られる共生生物として1935年に記載されてディフィシルは後に抗生物質治療2に関連した偽膜性大腸炎の原因物質であることが実証されました。Cをディフィシル感染症(CDI)は、典型的にはCのニッチを作成して、正常な結腸細菌叢の破壊をもたらし、抗生物質による治療が先行している2℃発育ディフィシルディフィシルは、糞口経路を介して休眠胞子として送信され、その後、いくつかの毒素を生成し、重篤な疾患や大腸炎3を引き起こすことができる栄養細胞を生産する、消化管の中に発芽している。 CDIは、多くの場合、従来の治療と、これらの中に抵抗性fectionsは、頻繁に再発4です。その結果、CDIは米国5-7の医療費で最大48億ドルを担当している。

クロストリジウム·ディフィシルは、環境中の酸素でさえ低レベルに非常に敏感である。 Cディフィシルが環境中に残留し、効率的にホストにホストから送信され、代謝的に不活性胞子の形成が重要で8です。なぜならCの実験室でのメンテナンスと操作ディフィシルは、これらの技術は、嫌気性チャンバーの使用を必要とし、制御され、嫌気性環境を必要とする。嫌気性チャンバーの使用は、偏性嫌気性菌の増加9-11回収及び単離をもたらした、分子の多くの技術が嫌気雰囲気下で行うことを可能にした。

C.に加えてディフィシルは 、ここで説明する嫌気性チャンバーの使用と保守が適用されますこのような他のクロストリジウム種( 例えばウェルシュ菌 )、他の胃腸の種( 例えばバクテロイデス12)と歯周病原体( 例えばペプトストレプトコッカス属 13)のような他の偏性嫌気性菌に。

Protocol

注:C.ディフィシルは、消化器疾患を引き起こす可能性があり、人間と動物の病原体である。 Cを含む実験ディフィシルは、適切なバイオセーフティに関する注意事項(BSL-2)を用いて実施されなければならない。 1。嫌気性チャンバー使用とメンテナンス クロストリジウム·ディフィシルは、厳密な嫌気性菌であり、大気中?…

Representative Results

Cの例BHISコロンビア嫌気ヒツジ血液寒天培地上で増殖させディフィシルは、 図2に見ることができる。C.ディフィシルは平坦であり、両方のメディアに明らかであるすりガラスの外観を持っている不規則なコロニーを形成している。ここでは、Cのエリスロマイシンに敏感な臨床分離株ディフィシル 、630E 30は 、37°C( 図2A)で…

Discussion

ここに記載された方法は、Cの簡単かつ迅速なリカバリを可能にヒト、マウスおよびハムスター、ならびにC.の長期保存を含む糞便サンプル、種々からディフィシルグリセロールまたは胞子ストックとしてディフィシルでディフィシルは、育成することは困難生物であってもよいが、慎重な嫌気性環境の維持と無菌技術の適用は、堅調な成長と汚染の低減?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは親切嫌気室の写真を提供するためのコイ研究所に感謝したいと思います。この作品は、DK087763(SMM)とSTEP /ハワードヒューズカリキュラム開発フェローシップ(ANE)を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
ᴅ-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
ᴅ-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml ᴅ-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

References

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Cite This Article
Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

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