Summary

Enterische Bacteriële invasie van darmepitheelcellen<em> In Vitro</em> Is het drastisch verbeterde Met behulp van een verticale Diffusion Kamer Model

Published: October 22, 2013
doi:

Summary

Uitvoeren celkweektesten voor het onderzoeken bacteriële adhesie en invasie onder aërobe omstandigheden is meestal niet representatief van de<em> In vivo</em> Milieu. Een verticale Diffusion Chamber model maakt studie van interacties van de menselijke ziekteverwekker<em> Campylobacter jejuni</em> Met intestinale epitheelcellen onder meer<em> In vivo</em>-Achtige omstandigheden, wat resulteert in een verhoogde bacteriële invasie.

Abstract

De interacties van bacteriële pathogenen met gastheercellen zijn uitgebreid onderzocht met in vitro celkweek werkwijzen. Maar als zodanig celkweekbepalingen worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden, die in vitro modellen kunnen niet nauwkeurig te vertegenwoordigen in vivo omgeving waarin de gastheer-pathogeen interacties plaatsvinden. Wij hebben een in vitro model van infectie die de co-cultuur van bacteriën en gastheercellen maakt onder verschillende middelgrote en gas omstandigheden ontwikkeld. De verticale Diffusion kamer (VDC) model bootst de omstandigheden in de menselijke darm waar bacteriën onder omstandigheden van lage zuurstof terwijl weefsel worden van zuurstof uit het bloed. Het plaatsen van gepolariseerde darmepitheelcel (IEC) monolagen gegroeid in Snapwell voegt in een VDC creëert aparte apicale en basolaterale compartimenten. De basolaterale compartiment wordt gevuld met celcultuurmedium, verzegeld en perfusie met zuurstof wHilst het apicale compartiment is gevuld met bouillon, open gehouden en geïncubeerd onder micro-aërobe omstandigheden. Zowel Caco-2 en T84 IECs kunnen de VDC wordt onder deze omstandigheden gehouden zonder duidelijke nadelige effecten op celoverleving of monolaag rechtschapen. Coculturing experimenten uitgevoerd met verschillende C. jejuni wild-type stammen en verschillende IEC lijnen in de VDC model met micro-aërobe omstandigheden in het apicale compartiment reproduceerbaar leiden tot een toename van het aantal interactie (bijna 10-voudig) en intracellulaire (bijna 100-voudig) vergeleken met aërobe bacteriën kweekomstandigheden 1. De omgeving gecreëerd in het VDC ​​model nauwer bootst de omgeving ondervonden door C. jejuni in de menselijke darm en benadrukt het belang van het uitvoeren van in-vitro-infectie testen onder omstandigheden die beter na te bootsen de in vivo werkelijkheid. Wij stellen voor dat het gebruik van het VDC-model zal toelaten nieuwe interpretaties van de interacties weddenWeen bacteriële pathogenen en gastheercellen.

Introduction

De interacties van bacteriële pathogenen met gastheercellen zijn uitgebreid onderzocht met in vitro celkweek werkwijzen. Het gebruik van dergelijke celkweek testen bacteriële hechting aan gastheercellen geïdentificeerd gastheercel receptoren gastheercel signaalwegen en bacteriële invasie van gastheercellen zijn allemaal in detail bestudeerd, waardoor veel belangrijke observaties. Maar zoals celkweektesten worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden die mogelijk niet representatief voor de in vivo omgeving. Een belangrijke beperking van in vitro modellen gebruikt om gastro-intestinale infecties studeren is dat de kweekomstandigheden, zoals hoge zuurstofgehalte in het algemeen voorstander van eukaryote cel overleving. Echter omstandigheden in de intestinale lumen vrijwel anaërobe. Darmpathogenen in een zeer lage zuurstof omgeving uiten virulentie genen waarvan de expressie veranderingen onder aërobe omstandigheden 2. Als zodanig verkregen middels standaard celcultuurmodellen may geven een onjuiste indicatie van bacteriële interacties met gastheercellen.

Campylobacter jejuni is de belangrijkste verwekker van bacteriële acute gastro-enteritis wereldwijd, met symptomen die variëren van milde diarree tot ernstige inflammatoire enteritis. De meeste C. jejuni infecties resulteren in ongecompliceerde gastro-enteritis, maar C. jejuni is ook de meest aangewezen besmettelijke agent in perifere zenuwaandoeningen waaronder Guillain-Barre syndroom (GBS). In het Verenigd Koninkrijk, wordt geschat dat er meer dan 500.000 gevallen van enteritis veroorzaakt door C. jejuni infectie elk jaar met een voorspelde kosten voor de Britse economie van £ 580.000.000. In de derde wereld, C. jejuni is een belangrijke oorzaak van sterfte onder kinderen. Ondanks het onbetwistbare belang van Campylobacter infectie en tientallen jaren van onderzoek, met inbegrip van gedegen genomics-gebaseerde analyse, C. jejuni pathogenese is nog steeds slecht understood, in tegenstelling tot andere enterische pathogenen zoals Salmonella, Escherichia coli, Shigella en Vibrio cholerae. Het ontbreken van een geschikte kleine diermodel is een belangrijke reden hiervoor 3. Ook de gebruikte in vitro infectiemodellen zijn ongeschikt voor het bestuderen Microaërofiele C. jejuni dan voor andere darmpathogenen die facultatieve anaërobe zijn. Hoewel C. jejuni wordt erkend als een invasieve ziekteverwekker, de mechanismen van C. jejuni invasie van intestinale epitheelcellen (IECs) zijn nog onduidelijk 4,5. C. jejuni invasie is aangetoond dat afhankelijk of microfilamenten, microtubuli, een combinatie van beide of geen 5. De verwarring in dit gebied is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van het gebruik van ongeschikte in vitro assay omstandigheden.

Een aantal verschillende celkweek assays werden gebruikt om de interacties van C. onderzoeken jejunimet gastheercellen. Caco-2 6, 7 INT 407 en T84 8 cellijnen allen toegepast om de hechting en invasie capaciteiten van verschillende C. bestuderen jejuni stammen. De niveaus van bacteriële adhesie en invasie van C. jejuni met IECs zijn dramatisch lager dan bij andere darmpathogenen 9. De coculturing van C. jejuni met IECs wordt gewoonlijk uitgevoerd in een CO2 incubator onder omstandigheden dicht bij atmosferische zuurstof, noodzakelijk voor de overleving van IECs. C. jejuni genexpressie zal heel anders zijn in de zuurstofarme omgeving van het darmlumen in vergelijking met atmosferische zuurstof voorwaarden.

Het gebruik van een verticale Diffusion kamer (VDC) systeem ontwikkeld waarbij de co-cultuur van bacteriën en gastheercellen onder verschillende medium en gascondities 1,10,11 toelaat. Dit systeem bootst de omstandigheden in de menselijke darm waar bacteriën un zalder problemen van zeer lage zuurstof terwijl weefsel worden van zuurstof uit het bloed. Gepolariseerde IEC monolagen gekweekt in speciale 0,4 urn filters werden geplaatst in een VDC creëren van een apicale en basolaterale compartiment, die individueel werden gevuld met bacteriële bouillon respectievelijk celkweekmedium (figuur 1). De VDC werd geplaatst in de variabele atmosfeer incubator bevattende 85% N2, 5% O2 en 10% CO2 bij 37 ° C, hetgeen optimale condities voor C. jejuni. De apicale compartiment open gelaten en blootgesteld aan het micro-aërobe atmosfeer binnen de variabele atmosfeer incubator, terwijl de verzegelde basolaterale compartiment werd zuurstof voorzien door een constante toediening van 5% CO 2/95% O 2 gasmengsel met een uitlaatbuis voorkomen accumulatie van druk . Caco-2 cel overleving en monolaag integriteit onder deze omstandigheden werden bevestigd door het toezicht op de transepitheliaal electrical weerstand (TEER) over de monolaag gedurende 24 uur voor het overleven van de Caco-2 cel monolaag en fysische scheiding van de apicale en basolaterale compartimenten onder lage zuurstofgehalte in het apicale compartiment tonen. De TEER monolagen in VDCs daarvan in de atmosfeer incubator variabele (micro-aërobe omstandigheden) en in een standaard celkweek CO2 incubator (aerobe omstandigheden) toonde geen significante verschillen, wat aangeeft integriteit van de cel monolaag onder verschillende weersomstandigheden 1. Onder microaerobe omstandigheden, krappe kruispunten bleef aanwezig en gelijkmatig verdeeld tussen de randen van cellen met een occludin kleuringspatroon vergelijkbaar met cellen gehandhaafd onder aërobe omstandigheden 1.

De interacties van C. jejuni met Caco-2 en T84 cellen in de VDC werden onderzocht door het beoordelen bacterie interacties (adhesie en invasie) en invasie. Twee verschillende C. jejuni wild-type strains werden 1. C. jejuni 11168H is een hypermotile afgeleide van de oorspronkelijke volgorde stam NCTC11168. De 11168H stam toont veel hogere kolonisatie niveaus in een kuiken kolonisatie model en wordt dus beschouwd als een geschikte stam te gebruiken voor gastheer-pathogeen interactie studies. 81-176 is een menselijke isoleren en is een van de meest ingrijpende uitgebreid bestudeerd laboratoriumstammen. C. jejuni stammen werden aan het apicale compartiment van een VDC onder hetzij microaerobe of aërobe omstandigheden. We waargenomen hogere tarieven voor zowel de interactie en de invasie werden geregistreerd voor C. jejuni onder micro-aërobe omstandigheden 1. De toegenomen C. jejuni interacties niet door een toename in bacteriële aantallen onder micro-aërobe omstandigheden 1. Deze gegevens ondersteunt onze hypothese dat het zuurstofarme omgeving in het apicale compartiment van de VDC verbetert bacterie-gastheer interacties en geeft aan dat de invasieve eigenschappen van C. jejuni zijn incrversoepeld onder deze omstandigheden. Dit was het eerste verslag van het gebruik van het VDC-model om een invasieve bacteriële pathogenen bestuderen en benadrukt het belang van het uitvoeren van in-vitro-infectie testen onder omstandigheden die beter na te bootsen de in vivo situatie. De VDC model kan worden gebruikt om gastheer-pathogeen interacties voor vele verschillende bacteriële species te bestuderen.

Protocol

1. Groei van IEC Monolayers op Special 0.4 micrometer Filters Cultuur Caco-2 cellen gemodificeerd essentieel medium van Dulbecco (DMEM) gesupplementeerd met 10% (v / v) foetaal kalfsserum, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 1% (v / v) niet-essentiële aminozuren in een standaard weefselkweek incubator bij 37 ° C in 5% CO2 en 95% lucht. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECs per 0,4 micrometer filteren en te groeien tot polarisatie meer dan 21 dagen, het veranderen van de media om d…

Representative Results

Coculturing experimenten uitgevoerd met een C. jejuni wildtype en IECs in de VDC model met micro-aërobe omstandigheden in het apicale compartiment een toename van het aantal interactie (bijna 10-voudig) en intracellulaire (bijna 100-voudig) vergeleken met aërobe bacteriën kweekomstandigheden in een tijd aangetoond afhankelijke wijze 1. Deze observatie was reproduceerbaar gebruik van twee verschillende C. jejuni wild-type stammen (11168H en 81-176) en twee verschillende IEC lijnen (Caco-2 …

Discussion

Het gebruik van in vitro celcultuur methoden om de interacties van bacteriële pathogenen bij gastheercellen studie is een techniek veel toegepast in vele laboratoria. Maar als zodanig celkweekbepalingen worden uitgevoerd onder aërobe omstandigheden, die in vitro modellen kunnen niet nauwkeurig te vertegenwoordigen in vivo omgeving waarin de gastheer-pathogeen interacties plaatsvinden. De gebruikte in vitro infectie modellen zijn vooral geschikt voor het bestuderen Microaërofiele <e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dominic Mills werd ondersteund door een Bloomsbury Colleges PhD studententijd (2007-2010). De auteurs willen graag zowel Ozan Gundogdu en Abdi Elmi bedanken voor hun hulp bij de ontwikkeling van het VDC-model.

Materials

Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts Harvard Apparatus 66-0001 Manifold & six Snapwell chambers
Caps Harvard Apparatus 66-0020
O-rings Harvard Apparatus 66-0007
Clamps Harvard Apparatus 66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm) Corning Costar 3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter Millipore MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer Biochrom 80-3003-72

References

  1. Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
  2. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
  3. Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
  4. Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
  5. Hu, L., Kopecko, D. J., Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. Chapter 17. Campylobacter. , 297-313 (2008).
  6. Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
  7. Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
  8. Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
  9. Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
  10. Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
  11. Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).

Play Video

Cite This Article
Naz, N., Mills, D. C., Wren, B. W., Dorrell, N. Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model. J. Vis. Exp. (80), e50741, doi:10.3791/50741 (2013).

View Video