La résistance acquise aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique et est actuellement classé par l'OMS comme l'une des plus grandes menaces à la vie humaine. Nous décrivons ici l'utilisation de la technologie de cantilever pour quantifier la résistance antibactérienne, essentielle à la découverte de nouveaux et puissants agents contre les bactéries multirésistantes.
La sonde en porte à faux, qui agit comme un transducteur de réactions entre le modèle bactérienne matrice paroi cellulaire immobilisé sur sa surface et des antibiotiques en solution, a montré un potentiel considérable dans les applications biochimiques de détection avec la sensibilité et la spécificité sans précédent 5.1. Les interactions médicament-cible génèrent des contraintes de surface, ce qui provoque le cantilever à plier, et le signal peut être analysé optiquement quand il est éclairé par un laser. La variation de la tension de surface mesurée avec une précision nanométrique permet de perturbations de la biomécanique de la paroi cellulaire bactérienne modèle Cibles à être suivis en temps réel. Malgré offrant des avantages considérables, de multiples réseaux de capteurs en porte à faux n'ont jamais été utilisées pour quantifier les interactions de liaison médicament-cible.
Ici, nous rapportons sur l'utilisation de silicium plusieurs tableaux en porte à faux avec enduit alcanethiol monocouches auto-assemblées mimant bactérienne matrice de la paroi cellulaire Stu quantitativementinteractions de liaison dy antibiotiques. Pour comprendre l'impact de la vancomycine sur la mécanique des structures de la paroi cellulaire bactérienne 1,6,7. Nous avons développé un nouveau modèle 1, qui propose que cantilever flexion peut être décrit par deux facteurs indépendants: i) soit un facteur chimique, qui est donnée par un Langmuir classique isotherme d'adsorption, à partir duquel nous calculons l'équilibre thermodynamique constante de dissociation (Kd) et ii) un facteur géométrique, essentiellement une mesure de la façon dont les récepteurs de peptides bactériens sont réparties sur la surface du cantilever. La répartition de surface des récepteurs peptidiques (p) est utilisée pour étudier la dépendance de la géométrie et de la charge du ligand. Il est démontré qu'une valeur seuil de p ~ 10% est essentielle pour les applications de détection. En dessous de laquelle il n'y a pas de signal détectable flexion tandis qu'au-dessus de cette valeur, le signal de fléchissement augmente presque linéairement, révélant que le stress est un produit d'un produit chimique locale contraignant facteur et un facteur géométrique combiné par la connectivité mécanique des régions réagi et propose un nouveau paradigme pour la conception d'agents puissants pour combattre les infections superbactérie.
Les moléculaires sous-tend la reconnaissance paradigme de larges pans de la biologie et de la médecine. En pharmacologie, par exemple, le but est d'interférer avec une voie pathologique en ciblant un acteur clé d'un processus biochimique comme transglycoslyation ou transpeptidation qui catalyse la réticulation des peptides de la paroi cellulaire bactérienne. La conception de médicaments se réduit donc à la définition d'une molécule apte à cibler un site d'amarrage bactérienne spécifique pour induire un ajustement parfait. Un exemple classique émuler le succès de cette approche est la vancomycine (Van), qui vise la paroi cellulaire peptidoglycane, une caractéristique structurelle conservé d'une bactérie. Dans une bactérie Gram-positive naissante, la matrice se compose de peptides peptidoglycane de terminaison dans la séquence Lysine-D-alanine-D-alanine, attaché par l'intermédiaire d'un C55 lipidiques 8-10 de liaison appelé ici D-Ala. Ces peptides exposés sur les précurseurs du peptidoglycane sont fondamentales pour laprotection mécanique des cellules bactériennes contre les forces environnementales difficiles, et surtout, on ne trouve pas dans les cellules humaines, faisant d'eux des cibles idéales pour les antibiotiques. Van lie spécifiquement à l'extrémité C-terminale des peptides de la paroi cellulaire bactérienne formant une assez forte Van-peptide complexe comme le montre la figure 1. Cette interaction entre Van et les peptides blocs exposés les actions de transpeptidases et transglycosylases, qui catalysent la réticulation des parois cellulaires 1, ce qui les empêche de réticulation et donc affaiblit nanomechanically la cellule bactérienne conduisant à sa mort par rupture 1,6, 7.
L'émergence de résistants à la vancomycine Enterococcus (ERV) est un problème croissant de santé 11 et parce que la résistance bactérienne chez les entérocoques se pose en raison du changement subtil d'un amide linkage à une liaison ester 8, ce changement structurel d'une simplicité trompeuse à la surface de la bactérie supprime une seule liaison hydrogène à partir du site d'accueil de Van avec modification ultérieure de la poche de liaison. Il est important de ce processus modifie le pentapeptide terminale alanine présent dans vancomycine sensibles Enterococcus (VSE) à un Lysine-D-alanine-D-lactate 10,12, ici appelé D-Lac, ce qui donne une réduction significative de Van-D-Lac affinité de liaison par trois ordres de grandeur rendu Van thérapeutique inefficace contre les infections à entérocoques 1, la croissance alarmante de bactéries résistantes aux antibiotiques est donc de conduire le développement d'approches novatrices afin d'accélérer et de restaurer l'activité antibactérienne des agents antibactériens ou la découverte de médicaments plus puissants contre les bactéries multirésistantes les infections.
<pclass = "jove_content"> Nos expériences utilisant des cantilevers autoportants est inspiré par des systèmes tels que les cellules qui exploitent l'énergie chimique en mouvement. La capacité des capteurs en porte à faux de traduire l'énergie chimique en mouvement mécanique rend sondes uniques avec des avantages considérables pour surveiller les perturbations mécaniques de cibles de la paroi cellulaire bactérienne en temps réel. Les capteurs de porte à faux exigent des «balises» pas journaliste et biomolécules sont détectées rapidement dans une réaction en une seule étape. Ils peuvent dépister plusieurs médicaments en parallèle dans des environnements physiologiques tels que des solutions tamponnées et le sérum ensemble. En outre, la technologie de cantilever utilise en référencement situ pour des mesures différentielles leur permettant de détecter spécifiquement les interactions médicament-cible et, en vertu de leur fabrication par des voies de traitement de semi-conducteurs standards, ils se prêtent à la production de masse et parallélisation pour le criblage à haut débit de milliers de médicaments par heure. En particument ses multiples réseaux de capteurs en porte à faux sont des outils utiles pour l'étude de la résistance aux antibiotiques à la vancomycine – parce que la résistance à la vancomycine est essentiellement un problème mécanique 1,6,7. Les réactions entre un modèle cible bactérienne de la paroi cellulaire et Van en solution peuvent être détectés en surveillant les variations de tension induites cliniquement significative de l'interaction de liaison médicament-cibles. La contrainte générée par des réactions de surface qui se manifeste par un signal de flexion en porte à faux est analysée optiquement par des détecteurs d'éclairage avec un faisceau laser. Par ailleurs, en adaptant le revêtement réceptif de molécules cibles de surface bactériennes sur le dessus du capteur cantilever, proches d'un nombre illimité d'analytes (Van), les interactions biochimiques spécifiques et la biomécanique du modèle bactérien matrice de la paroi cellulaire est suivie en temps réel. Mis à part le cas de la reconnaissance moléculaire, il ya plusieurs facteurs qui peuvent causer des capteurs en porte à faux à deflect, qui comprennent – des variations de température, de liaison non spécifiques ou des changements d'indice de réfraction de la solution. Pour tenir compte des signaux non spécifiques, à des mesures différentielles situ sont effectuées lorsque la courbure de fois la mesure et consoles de référence sont surveillés en permanence pour analyser les interactions spécifiques. En outre, la sensibilité de détection des capteurs de porte à faux qui dépendent des chimies de surface et de la géométrie peut être améliorée en réglant la densité de surface p (où p est défini comme le rapport de la surface occupée par les molécules de capture pour la totalité de la surface supérieure de la porte à faux couvert par la population totale de molécules telles que déterminées par rayons X spectroscopie photoélectronique (XPS) 1.Voici ce protocole de détails comment la vancomycine ou tout autre antibiotique liaison à bactériennes mur analogues de précurseurs cellulaires (mucopeptides) à des concentrations cliniquement pertinentes dans une solution tamponnéesérum sanguin e peut être détectée à l'aide de la technologie de cantilever sans étiquette. Surfaces d'or frais sont utilisés parce monocouches auto-assemblées (SAM) ont tendance à former facilement des couches stables sur l'or propre 13,14. SAM est typiquement constitué de molécules courtes avec une fraction thiol lié de manière covalente à la surface de l'or, tandis que l'unité de capture désiré sur l'autre extrémité est autorisé à interagir librement avec les cibles de l'analyte en solution. Thiols forment un système souple d'autant plus que de nombreux composés thiols avec différents groupes terminaux chimiques sont disponibles dans le commerce ou sont facilement synthétisés en laboratoire. Cependant, des précautions doivent être prises pour s'assurer que les molécules avec un groupement thiol doivent avoir des groupes terminaux appropriés, par exemple dans une protéine ou conjugaison peptide, le groupe amino doit faire face vers l'intérieur pour la réaction avec le groupe carboxylique du groupement thiol attaché sur le surface pour se produire. Ici, les thiols sont directement conjugué par des composés mimétiques tripeptidiques d'origine bactérienne lipide II de la bparoi cellulaire acterial objectifs synthétisé par la méthode en phase solide à l'aide disponible dans le commerce préchargé Wang-D-Ala et résines Wang-D-Lac et le niveau protecteur Fmoc groupe chimie 15. Bien que cette description se concentre à la vancomycine, clairement il peut être étendu à d'autres antibiotiques et bien d'autres études sont invités par des chercheurs de différents domaines notamment en biochimie, la pharmacologie et la science des matériaux à adopter facilement ce protocole pour leurs propres expériences.
Ces résultats démontrent que les capteurs de la matrice de cantilevers ont la sensibilité pour détecter et quantifier les changements dans les interactions de liaison médicament-cible en particulier la résistance à la vancomycine associée à la suppression d'une seule liaison hydrogène de poche de liaison de la drogue. Nous montrons une sensibilité de détection nanomolar de Van en accord avec résonance plasmonique de surface (SPR) des études antérieures 18,19, et révèlent que la méthode cantilever peut directement détecter et de quantifier les molécules de médicament dans le sang à des concentrations cliniquement pertinentes appliquée en routine dans la pratique clinique. Nos données suggèrent que la contrainte de surface différentielle peut être décrite par une équation de forme du produit (1), soit (i) un terme chimique décrivant les événements de liaison médicament-cibles spécifiques, et (ii) un terme géométrique décrivant la connectivité mécanique entre réagit chimiquement sites de surface, ce qui implique que les interactions chimiques locales découpler de la mécanique mondialeinteractions al de la console. Bien que le terme chimique est donnée par la Langmuir classique isotherme d'adsorption, le terme géométrique révèle un mécanisme percolative des médicaments ciblés changements de contraintes de surface induits. Le seuil critique pc ~ 10% (figure 5) est nécessaire pour détecter la différence de flexion en porte à faux, qui montre que les contraintes de surface est transduit collectivement lorsqu'une fraction relativement importante de la surface est occupée par des molécules antibiotiques. Pour p ≥ pc, la connectivité mécanique entre les sites de surface transformées chimiquement est progressivement mis en place, et les interactions répulsives à courte portée tels que les interactions stériques entre les nœuds du réseau nanomécanique donne lieu à l'augmentation de pliage vers le bas de l'ensemble du cantilever. Il est spéculé que notre modèle de percolation nanomécanique peut jouer un rôle important dans le mode antibiotiques glycopeptides de l'action des bactéries réels. Ces résultats mettent en évidence la grande sensibilité de la technologie de cantilever pour studying le mode d'action des antibiotiques et de représenter un outil de recherche roman pour étudier des médicaments pour améliorer la compréhension des opérations d'antibiotiques à l'échelle nanométrique pour informer et permettre la découverte de médicaments puissants pour contrôler les problèmes d'infections superbactérie. Pour préparer le système cantilever pour des mesures reproductibles et sensibles, nous avons abordé un ensemble de cibles dans le protocole, en particulier pour le chargement de l'échantillon dans les procédures normalisées d'exploitation pour permettre détections nanomécaniques quantitatives cellule microfluidique et.
Importance de la technologie en porte à faux par rapport aux méthodes existantes
En résumé, nous signalons que si cette technologie a été proposée il ya plus de 25 ans, elle n'a pas trouvé sa place dans la clinique en raison du manque de mesures précises et répétitives sur médicalement cibles pertinentes. Ici, nous démontrons les procédures qui établissent la pertinence de l'utilisation de consoles nanomécaniques pour enquêter sur la mécaniqueal influence des antibiotiques sur les objectifs de la paroi cellulaire bactérienne et à détecter la résistance antibactérienne. Les méthodes classiques de dépistage de drogues exigent un certain type de marquage fluorescent ou radioactif d'une molécule rapporteur pour mesurer la liaison d'un analyte à sa cible, souvent dans le cadre d'un essai de liaison compétitive ou enzymatique et des dosages de la protéine 20. Marquage des biomolécules n'est pas seulement fastidieux et coûteux, mais l'étiquette peut également interférer avec l'interaction moléculaire en bloquant le site de liaison, ce qui conduit à des faux négatifs. En outre, les composés fluorescents sont souvent hydrophobe qui peut conduire à fond positifs contraignantes et faux. En raison de ces limitations, il ya un intérêt croissant pour les nouvelles techniques sans étiquette qui permettent à n'importe quel complexe moléculaire à cribler avec le développement du dosage minimal. Les technologies de surface sans étiquette plus établies à l'heure actuelle sont SPR et Quartz Crystal Microbalance (QCM). Contrairement à la SPR qui mesure èmeconstante diélectrique e, une étiquette – la technologie en porte à faux libre détecte la déformation de la surface générée par une interaction ligand-récepteur, ce qui permet de mesurer directement les forces nanomécaniques générés par la liaison spécifique de ligands à des récepteurs de surface. L'originalité de ces capteurs est que leur sensibilité ne repose pas sur des propriétés diélectriques causés par le changement de masse due à la liaison comme dans SPR et QCM, mais plutôt d'un changement induit par moindres dans le stress de surface dans le plan analyte, rendant la technologie adaptée de façon unique pour étudier les nanomechanics des molécules de médicaments à des concentrations d'antibiotiques cliniquement pertinentes (3-27 M) 17. Cantilevers sont également particulièrement bien adaptés à petite molécule (tels que des fragments d'ADN et les médicaments) la détection dans des conditions physiologiques, y compris des environnements complexes qui est en grande partie la base de l'industrie pharmaceutique et servira donc comme un outil complémentaire dans la découverte de médicaments. technologie de luge ont été appliquée avec succès dans ledomaines de la génomique 3,5, détection de gaz 21, 22, protéomique et de la drogue 1. En outre, cantilevers sont fabriqués en utilisant la technologie du silicium à faible coût et en raison de leur compatibilité avec les procédés de microfabrication, leviers peuvent être miniaturisés pour améliorer la sensibilité et la parallélisation dans de grands réseaux de capteurs pour plusieurs dépistage du composé médicamenteux et riche en informations essais de criblage de débit supérieur. Amélioration de l'instrumentation et la conception expérimentale permettra une grande variété d'interactions à analyser en temps réel pour faire avancer la recherche d'une nouvelle génération de Superdrugs pour s'attaquer aux problèmes de la tuberculose infections résistantes.
Les étapes critiques dans le protocole
L'élaboration de protocoles de mesure robustes est essentielle pour les applications de cette technologie. Pour obtenir des mesures de drogues cibles quantitatives satisfaisantes et de déterminer la plus faible concentration d'antibiotiques tchapeau n'a pu être détectée dans le tampon ou du sérum sanguin, les étapes critiques dans le protocole ont été abordés. La première tâche consiste à réglage et l'optimisation de chimies de capture de surface pour améliorer la spécificité de détection de luge et de sensibilité. Incontestablement, le stress de transduction de surface est un phénomène collectif, ce qui nécessite une assez grande partie de la surface à recouvrir pour établir la connectivité entre régions chimiquement réactifs. On montre qu'en faisant varier la densité des peptides de surface sous-jacentes, d'un seuil critique ~ p ≥ 10%, est déterminée lorsque l'ampleur des contraintes de surface en fonction de la densité et zéro sinon peptide (figure 5). Il est important que les expériences sont conçues pour étudier l'uniformité de contraintes le long des leviers pour assurer déviations de signal maximum pour les mesures sensibles. En outre, les protocoles de régénération de surface efficaces doivent être mis en place, permettant ainsi à de multiples mesures de cycle et de réduire les coûts pour chaque TESt. Lors de la conception d'une surface réceptrice à l'aide extrémité hydrophobe thiolé, l'orientation de la molécule de récepteur et de l'espacement entre eux est indispensable pour permettre l'auto-assemblage de la forte densité de remplissage en raison des interactions de Van-der-Waals entre les molécules de minimiser les interactions non spécifiques. De plus, les molécules de capture devraient contenir un polyéthylène glycol (PEG) de liaison pour permettre à une partie de la matrice de détection pour être hydrophile pour éviter l'insertion de molécules dans la solution de substance à analyser de réagir directement avec la surface non revêtue d'or. Les molécules de liaison PEG doivent agir comme des entretoises pour réduire les contraintes stériques et permettent donc les analytes de solutions d'interagir spécifiquement avec les récepteurs de surface pour induire un changement de contrainte de surface mesurable. Le capteur matriciel d'cantilever doit être dosé avec au moins une mesure de référence en place et le signal affiché en temps réel est une flexion différentielle, obtenue par soustraction de la déviation absolue du cantilever de référence à partir de l'artEnsing cantilevers. Ainsi, un cantilever de référence est essentiel de tenir compte des interactions non spécifiques tels que des changements de température, les changements dans l'indice ou des interactions sur la face inférieure de la poutre non fonctionnalisé réfraction. L'optimisation de la vitesse d'écoulement (~ 30 à 150 pl / min) constitue une étape critique dans le protocole, car elle assure un échange efficace de liquides et un transport de masse constante suffisante de matières en solution. La conception d'une cellule liquide doit permettre volume optimal (5-80 pi) pour des débits rapides pour permettre l'échange liquide parfait pour surmonter les limitations de transport de masse. Le débit est particulièrement important lors de l'exécution des mesures cinétiques 23. Vastes chambres de liquide de volume nécessitent des débits élevés incontrôlables conduisant à de grandes exigences en matière de volume de l'échantillon, ce qui augmente inutilement le prix de l'essai. Auparavant, nous avons utilisé l'écoulement par gravité à injecter différents échantillons dans la chambre de liquide de mesure. L'écoulement par gravité a l'avantage de biches ne nécessitera pas de pièces mécaniques et n'a donc pas introduire de bruit supplémentaire dans le système. Cependant, son inconvénient majeur est qu'il ne fonctionne de manière fiable à des débits relativement élevés (~ 200 pi / min). Évidemment, un débit plus faible (≤ 1 pi / min), il faudrait des volumes d'échantillons limités par unité de temps, mais d'autre part il rend les réactions beaucoup plus lent et nécessite donc plus de temps de contact. De plus, l'écoulement par gravité a une grande variance dans son débit car il dépend de la différence de hauteur entre l'entrée et la sortie, ce qui diminue à mesure que les solutions d'échantillon sont consommés au cours de l'expérience. Pour éviter les problèmes d'écoulement par gravité, une pompe seringue doit être utilisé. L'avantage d'utiliser une pompe seringue est qu'il permet un débit constant sur une longue période de temps permettant des expériences à réaliser dans un environnement plus contrôlé.
Limitations du protocole
Le défi majeur dans l'obtention d'un reproductible uned détection biologique spécifique à l'aide des capteurs de porte à faux se trouve en veillant à ce que les propriétés de la couche réceptrice sont biochimiquement "actif" et uniforme pour chaque essai. Le secret de la réussite expérimental est dans un pré-traitement attentif de la puce de capteur avec un nettoyage et d'un protocole normalisé d'immobilisation avec chimies de liaison à orienter les molécules de récepteur dans leur conformation active. Dans notre configuration actuelle, nous fonctionnaliser des tableaux en porte à faux à l'aide de petits capillaires en verre, ce qui pourrait être soumis à certains inconvénients et peut être problématique dans certains cas. Ces capillaires en verre sont ouverts aux deux extrémités et donc les solvants de l'échantillon peut s'évaporer facilement. Par exemple, si la température de l'étape de fonctionnalisation n'est pas contrôlée avec précision, le taux d'évaporation peut varier de façon importante à différents moments en particulier lors de l'utilisation des solvants volatils tels que l'éthanol. Il ya aussi une possibilité de légère variation dans le temps d'incubation d'une console à l'autre gtant donné que les liquides de détection doivent être chargées successivement dans les capillaires. L'autre facteur limitant dans la fonctionnalisation capillaire est le manque de capacité à faire en sorte que cantilevers sont toujours insérés dans les capillaires exactement de la même façon. De plus, parfois, les leviers doivent être légèrement extraite à partir des capillaires afin d'éviter toute contamination croisée comme les échantillons liquides peuvent s'écouler sur le corps de puce. Nous pouvons résoudre ces problèmes en utilisant des spotters jet d'encre comme une procédure de revêtement de surface alternative aux consoles de manteau. Bien que cela permettrait le contrôle exact de revêtement de l'échantillon avec la possibilité d'augmenter sa production de grands tableaux, l'inconvénient le plus commun est que les petites gouttes qui se déposent sur les leviers peuvent s'évaporer en quelques secondes et nécessite un environnement à humidité contrôlée. Par conséquent, le temps d'incubation ne peut être réglé facilement, ce qui pourrait être souhaitable pour certaines applications. Le jeu subtil des facteurs tels que l'échantillon volume, le temps d'incubation et le taux d'évaporation ont un impact direct sur l'exposition des cantilevers à l'échantillon de fonctionnalisation et de soins doivent être prises pour assurer la chimie de surface optimisés pour les essais en porte à faux comme toute petite variation dans la densité moléculaire du récepteur aura un grand effet sur le cantilever réponse.
Modifications de conception expérimentale (par exemple des techniques ou des matériaux de substitution)
Pour surmonter le défi majeur dans l'obtention procédure de revêtement reproductible pour le développement futur de la technologie de cantilever, différentes stratégies sont nécessaires qui utiliserait consoles intégrées dans les canaux microfluidiques. L'idée est que les puces en porte à faux spéciaux devraient être conçus de telle sorte que chaque console est placée dans son propre canal pour permettre ligne dans les procédures de fonctionnalisation in situ où les canaux sont traités individuellement. Ces modifications de conception expérimentales permettraient procédé de revêtement à effectuered dans un environnement contrôlé et fermé où l'exposition au solvant est précisément contrôlé par le temps d'incubation et la vitesse d'écoulement pour l'immobilisation automatique de molécules de capture sur des puces en porte à faux. Les mêmes canaux pourraient alors être utilisés pour les expériences de liaison réels où tous les leviers pourraient être exposés à la même solution d'analyte. Outre la procédure de fonctionnalisation en porte à faux, le mécanisme de lecture de cantilever aurait aussi besoin d'amélioration. La méthode de déviation du faisceau optique est très sensible et il a été utilisé avec succès dans la technologie microscopie à force atomique (AFM) depuis de nombreuses années. Néanmoins, pour les applications de capteurs en porte à faux autoportants la lecture optique présente certains inconvénients, par exemple, il ne permet pas de mesures dans les liquides opaques tels que le sang, l'alignement d'un réseau de lasers peut être longue et fastidieuse et la configuration actuelle ne peut pas différencier entre débattements pendulaires et vertical. Ainsi, le développement futur de la cantilevtechnologie er devra tenir compte des aspects de la conception du capteur général (par exemple, des géométries de cantilever) et l'affichage de la console pour les protocoles de mesure robustes à la fois dans les domaines et les environnements de laboratoire. Manalis et ses collègues 22 ont développé de nouveaux types de capteurs en porte à faux creux où les consoles ont un canal microfluidique intégré à l'intérieur du faisceau, ce qui permet au dispositif d'être utilisé dans un vide avec des facteurs de qualité. Dans ce mode, cantilevers agissent comme microbalance 22, et par conséquent, il n'est plus nécessaire d'avoir une asymétrie entre les deux parties en ce qui concerne la fonctionnalisation, ainsi les molécules de capture peuvent être physisorbée ou fixés de manière covalente directement sur le silicium, typiquement en utilisant SAM ou de silanes 24. Les leviers peuvent également être modifiés par une couche mince de polymère, qui est ensuite conjugué à l'anticorps 25, pour la détection biochimique.
Dépannage
Un pro communeblème associé aux mesures de cantilever est l'introduction de bulles d'air dans la cellule d'écoulement microfluidique. Des précautions doivent être prises pour s'assurer qu'aucune bulle d'air sont introduits dans la cellule liquide lors du montage de la puce. Signal dérive est aussi un autre problème commun provoqué par les différences de température des échantillons. Les consoles doivent être équilibrés à stabiliser avant que les mesures soient prises. Tous les tampons, des analytes et des solutions de régénération doivent être stockés dans la même chambre que l'instrument en porte à faux pour permettre à toutes les solutions qui ont à la même température. Bien que le pousse-seringue peut fournir des débits très précis et extrêmement faible, il est généralement associée à des bruits mécaniques dans les mesures en porte à faux. Il est donc important de concevoir une solution simple et efficace réducteur de bruit pour éviter les bruits inutiles dans les signaux de déviation. Le réducteur de bruit se compose de petit réservoir de liquide situé entre la pompe à seringue et la cellule de liquide, qui absorbe til bruit mécanique de la pompe. En raison de la nature sensible du détecteur optique, le système de mesure de la console devrait idéalement être utilisé dans une configuration fermée pour bloquer toute lumière parasite d'interférer avec le système de lecture optique. En outre, la qualité des couches de détection peut diminuer considérablement si un grand nombre d'étapes de lavage sont effectuées sur les consoles limitant la durée de vie de la puce du capteur.
D'autres applications ou à venir après avoir maîtrisé cette technique
Cantilevers revêtues de SAM se terminant par un groupe amino-ou carboxy-groupe peuvent être utilisés en tant que capteurs de pH. Les groupes terminaux fonctionnels protoner ou déprotoner en fonction du pH de la solution et peuvent générer une charge de surface qui conduit le cantilever à plier 24. Étant donné que les capteurs de cantilever peuvent suivre les interactions médicament-cible associée à la déstabilisation de la paroi cellulaire des bactéries de la vie 1,6,7, ils vont donc aider àla recherche et le développement d'une nouvelle génération d'antibiotiques pour combattre les infections résistantes aux médicaments. En cantilevers futures seraient utilisés comme microbalances pour mesurer la masse et le taux de croissance des cellules individuelles 26. La technologie de cantilever sera bénéfique à l'étude des réponses cellulaires aux différents facteurs de croissance ou des médicaments. Il offrira également un nouvel outil pour la détection rapide de plusieurs biomarqueurs, qui a une pertinence immédiate pour des applications médicales et le point-of-care. Compte tenu de la polyvalence, de petite taille, et la robustesse des capteurs en porte à faux, ils formeront un écran sensible des facteurs environnementaux nocifs. Ils ont déjà démontré leur sensibilité dans la détection des gaz toxiques et nocifs qui peuvent s'échapper du laboratoire et les unités de production industrielle dans l'environnement, tels que l'acide fluorhydrique 27 ou le cyanure d'hydrogène 28.
The authors have nothing to disclose.
Joseph W. Ndieyira a été soutenue par le Conseil ingénierie et sciences physiques Research (EPRSC), Centre interdisciplinaire de recherche en nanotechnologie (IRC), la Royal Society (RS) et Biano conseil (BNC). Nous remercions, Alejandra Donoso Barrera, Dejian Zhou, Manuel Vögtli, Matthew Batchelor, Matthew A. Cooper, Torsten Strunz, Trevor Rayment et Gabriel Aeppli pour des discussions utiles.
Items | Catalog Number | Company | Comments |
Scentris | Scentris, Veeco Instruments, Inc | Not in production | |
Six-way valve | MVP, Hamilton, Reno, NV | Enables multiple concentration injection | |
EB Evaporator | BOC Edwards Auto 500, UK | Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems | |
Storage vessel | Agar Scientific, UK | Keeps gold coated films fresh | |
Glass capillary | King Precision Glass, Claremont, CA, USA | For capillary functionalization of the cantilever arrays | |
Pump | Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA | Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels | |
0.2-4.5 μm Filters | 1511940001 | Merck Millipore | For sample filtering |
Cantilever chips | London Centre for Nanotechnology (LCN) | Highly sensitive | |
Sodium phosphate monobasic | 10049-21-5 | Sigma-Aldrich, UK | For making buffer solutions |
Sodium phosphate dibasic | 7558-79-4 | Sigma-Aldrich, UK | For making buffer solutions |
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80 | 9005-65-6 | Sigma-Aldrich, UK | Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware |
DI water | Millipore Co., Billerica, MA, USA | Used for making solutions | |
Whole serum | GEM-700-110-H | Sera Laboratories International Ltd, UK | Used in measurements that mimic physiological conditions |
Vancomycin (Van) | 1404-93-9 | Sigma-Aldrich, UK | Drug used |
Sulfuric acid | 7664-93-9 | Sigma-Aldrich, UK | Used for glassware cleaning procedures |
Hydrogen peroxide | 7722-84-1 | Sigma-Aldrich, UK | Used for glassware cleaning procedures |
D-Ala and D-Lac | London Centre for Nanotechnology (LCN) | Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions | |
LabView | National Instruments Co., Austin, TX, USA | Software used for instrumental interface to allow controlled measurements | |