Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits
Summary
Faagdisplay is een krachtige techniek om eiwitten of eiwitcomponenten die interageren met een geïmmobiliseerd molecuul van belang vangen. Zodra een beslissing van de aard van de faag cDNA bibliotheek creëren en het scherm is gemaakt, de hier beschreven protocol maakt efficiënte affiniteit selectie leidt tot de identificatie van interactoren.
Abstract
Met recombinante faag als een scaffold verschillende eiwitgedeelten gecodeerd door een directioneel gekloneerd cDNA bibliotheek geïmmobiliseerde aas moleculen presenteren een efficiënte manier om interacties te ontdekken. De techniek is grotendeels gebruikt voor eiwit-eiwit interacties ontdekken, maar het aas molecuul uitgedaagd hoeft niet beperkt tot eiwitten. Is geoptimaliseerd De gepresenteerde protocol om een bescheiden aantal aas worden gescreend in duplo op de identificatie van onafhankelijke klonen met hetzelfde eiwit maximaliseren. Dit maakt een grotere vertrouwen dat interacterende eiwitten geïdentificeerd zijn legitiem interactoren van het aas molecuul. Monitoring van de faag titer na elke affiniteit selectieronde geeft informatie over hoe de affiniteit selectie evenals vordert over de werkzaamheid van negatieve controles. Een middel titering de faag, en hoe en wat te bereiden op voorhand, zodat dit proces zo efficiënt vooruitgangmogelijk wordt gepresenteerd. Attributen van amplicons teruggevonden na isolatie van onafhankelijke plaque worden benadrukt dat kan worden nagegaan hoe goed de affiniteitsselectie is gevorderd. Trouble shooting technieken om valse positieven te minimaliseren of te omzeilen voortdurend hersteld fagen worden toegelicht. Middel om virale besmetting oplaaien worden besproken.
Introduction
Waarom gebruik maken van faag display en affiniteit selectie plaats van de talloze andere technieken beschikbaar voor het ontdekken en onderzoeken van eiwit interacties met andere moleculen? Faag display conclusie aantal unieke voordelen boven andere werkwijzen voor het detecteren van eiwit-ligand interacties 1-3 zoals:
Zeer breed repertoire van aas moleculen
De belangrijkste reden is de verscheidenheid van moleculen die als aas affiniteitsselectie 4. Faagdisplay is een zeer krachtig middel isoleren eiwitfragmenten die interageren met andere eiwitten, nucleotiden, koolhydraten, enz. 5 In wezen, als een polymeer / molecuul kan worden bevestigd aan een herstelbare steun kan worden gescreend op affiniteit met faag display eiwitten. Bovendien kan het aas molecuul toegankelijk te bepalen of biologische activiteit behoudt wanneer geïmmobiliseerd 6, indien de gebruiksomstandigheden reduce / haar activiteiten te elimineren effectief zijn 6 of, aan post-translationele modificaties aan het aas voorafgaand aan affiniteitsselectie introduceren.
Faag weerstand tegen externe factoren
Een tweede reden om faag display, is dat het mogelijk is dat sommige aas omgevingsstress (warmte, hoge osmolyt concentraties specifieke cofactoren, etc..) Kunnen vereisen om hun interagerende eiwitten vangen, of faag display eiwitten moeten andere manier worden gewijzigd vóór affiniteitsselectie. De primaire factor die onderzocht is de interactie tussen aas en eiwitten, niet de voorwaarde waarmee de interactie voordoet of als het dodelijk voor het testorganisme. De T7 faag is bijzonder geschikt voor deze studies, omdat het bestand is tegen zware proefomstandigheden zowel intacte en levende (bij voorbeeld de gepubliceerde thermische maximum T7 levensvatbaarheid ~ 60 ° C 7). Als voorbeeld van de verandering faagweergegeven proeiwitten, bij het onderzoek van de Arabidopsis thaliana zaad proteoom voor eiwitsubstraten het reparatie-enzym, Eiwit Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), het virus gebruikt in deze studies hadden "verouderd" geweest voor een week, voorafgaand aan elke affiniteit selectieronde, om invoering te stimuleren van isoaspartate (isoAsp) resten bij gevoelige eiwitten 6 die niet mogelijk in organismen die kunnen herkennen en reparatie / metaboliseren dergelijke eigenschappen.
Metabolisch inert
Bovendien, de faag zijn meestal resistent tegen metabolische gif en storende kleine moleculen die zou, op zijn minst, resulteren in pleiotrope effecten op metabolisch actief testorganismen. Na de stringentie wassen, wordt het gif voor een grote hoeveelheid bacteriën worden ingevoerd voor infectie zodat het gif wordt verdund tot een bereik onschadelijk bacteriën of volgende faagreplicatie verwijderd. Tijdens het onderzoek naar eiwit targets van de PIMT reparatieenzym, S-adenosylmethionine (AdoMet) werd gebruikt om de micro-titer plaat putjes geïmmobiliseerd enzym activeren doeleiwit afvangvergunning weliswaar afhankelijk van S-adenosyl Homocysteine (AdoHcy) om het enzym te inactiveren en een nuttig negatieve controle vast te de wetenschap dat het virus niet nadelig worden beïnvloed door een AdoMet of AdoHcy 6. Bovendien, leden van bepaalde Late embryogenese Overvloedige (LEA) eiwitfamilies, onderzocht bij deze lab, zijn bekend om hun vorm in aanwezigheid van additieven zoals sucrose 8, waarin de concentraties zo hoog als 200 mM in sojazaden kan opbrengen op het punt wijzigen van fysiologische rijpheid 9. Het virus wordt niet verwacht te worden beïnvloed door toevoeging van 200 mM sucrose in elke affiniteit selectieronde, dat noodzakelijk bepaalde LEA-client eiwit interacties, wat niet het geval autonoom levensvatbare testorganismen 10.
Dit lab is gericht op discoverinG eiwit-eiwit interacties in rijpe, gedehydreerd of kiemende zaden die het mechanisme opgeslagen bescherming proteoom tijdens dehydratatie 11 of reparatie van onderdelen van de opgeslagen proteoom die gevoelig isoAsp vorming zijn nadat het zaad ingezogen 6 grondslag liggen. Zo is de productie en zuivering van de recombinante eiwitten nodig als aas in een actieve toestand, en ervoor te zorgen dat ze zo blijven, voor en nadat ze zijn geïmmobiliseerd, hoewel vaak moeilijk is, is een hoeksteen voor ons werk. Aangezien elk recombinant eiwitproductie scenario is verschillend, optimaliseren voorwaarden voor recombinante eiwitproductie hier niet worden behandeld. Gebruikers worden aangespoord om te proberen, waar mogelijk, om te bepalen of het geïmmobiliseerde eiwit is nog steeds functioneel (bijvoorbeeld als het gaat om een enzym, doe een enzym assay in de microtiterplaatputjes). Dit zal enige vertrouwen dat het aas is biologisch actief zijn en derhalve, dat elke ontdekte interactieswat vaker biologische relevantie hebben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door het uitvoeren van het experiment drie gerepliceerde wells, onafhankelijk verkregen faag van hetzelfde eiwit binding aan het aas te onderscheiden, zelfs als ze dezelfde kloon (dus geen verschil in de nucleotidesequentie van de CDS gebied dat is verworven en deze zijn opgehaald uit onafhankelijke bronnen). Anders is de enige manier om onderscheid te maken tussen faag codeert voor hetzelfde eiwit binding aan het aas is als ze onafhankelijk reverse getranscribeerde gebieden die verschillen in een deel van de n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door een NSF IOS (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011-04375), en Sir Frederick McMaster Research Fellowship aan ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
