Summary

Forward Genetische technieken in<em> Chlamydia trachomatis</em

Published: October 23, 2013
doi:

Summary

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Abstract

Chlamydia trachomatis, het etiologische agens van seksueel overdraagbare ziekten en oculaire infecties, blijft weinig gekarakteriseerd door zijn ontoegevendheid experimentele transformatie met recombinant DNA. We ontwikkelden een aanpak om genetische analyses uit te voeren in C. trachomatis ondanks het gebrek aan moleculair genetische hulpmiddelen. Onze methode bestaat uit: i) chemische mutagenese om snel genereren van uitgebreide bibliotheken van genetisch gedefinieerde mutanten met verschillende fenotypes; ii) hele genoom sequencing (WGS) naar de onderliggende genetische letsels in kaart en associaties tussen gemuteerde gen (s) te vinden en.. een gemeenschappelijk fenotype;. iii) genereren van recombinante stammen door co-infectie van zoogdiercellen met mutant en wild type bacterie. Dienovereenkomstig, waren we in staat om causale verbanden tussen genotypes en fenotypes vestigen. De koppeling van chemisch-geïnduceerde gen variatie en WGS aan correlatieve genotype-fenotype associaties vast Should in grote lijnen van toepassing zijn op de grote lijst van medisch en ecologisch belangrijke micro-organismen momenteel hardnekkige naar genetische analyse.

Introduction

De obligaat intracellulaire bacterie Chlamydia trachomatis is goed voor een geschatte 2,8 miljoen genitale infecties per jaar in de Verenigde Staten (Center for Disease Control) met bijbehorende complicaties zoals bekken ontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschappen en onvruchtbaarheid (1). Chlamydia spp hebben een unieke fysiologie met een bifasische ontwikkelingscyclus uit twee vormen: de infectieuze maar niet replicerende elementaire lichaam (EB) en infectueuze maar replicatieve netvormige body (RB). Infectie begint met de bevestiging van EBS aan epitheelcellen endoctyotosis gevolgd door (2). Binnen een membraangebonden vacuole genoemd een opname, EBS differentiëren in de RB vorm, die vervolgens repliceert door binaire splijting. Halverwege de cyclus, RBS overgangen terug in EBS, die vervolgens worden uitgestoten in de extracellulaire ruimte om nieuwe serie infecties teweeg wanneer de gastheercel lyses (3).

C. trachomatis isongevoelig routine manipulatie met standaard moleculaire genetische hulpmiddelen, zoals gerichte genvervanging, transposons en transducerende fagen, die centraal in de meeste studies in bacteriële genetica hebben, is onduidelijk welke mate individuele Chlamydia genen in het ontduiken van aangeboren immuniteit , nutriënten verwerving, ontwikkelings overgangen of andere processen van belang voor het overleven van de ziekteverwekker in een eukaryotische gastheer (4). Bijgevolg is deze ziekteverwekker blijft slecht gekarakteriseerd ondanks zijn klinisch belang.

De genomen van Chlamydia spp. zijn relatief klein (~ 1 Mb) (5) met meerdere soorten en biovars gesequenced met behulp van Next Generation sequencing technologieën. Vergelijkende genoomanalyse door WGS heeft een uniek inzicht in de evolutie van Chlamydia species en hun aanpassing aan de mens (6-8) en tot op zekere hoogte heeft enige informatie verstrekt over de mogelijke functie van virulentiefactoren (9, 10). THij genetische diversiteit weergegeven door klinische isolaten niet voorziet de resolutie die nodig is om systematisch in kaart de functie van de meeste virulentiefactoren, vermoedelijk omdat mutaties in dergelijke genen zou zijn gemakkelijk geselecteerd tegen. Zonder verstorende effecten van natuurlijke selectie, mutageen-geïnduceerde gen variant, in combinatie met gedefinieerde assays die maatregel defecten in virulentie, kan het spectrum van mutaties die kunnen worden onderzocht breiden. Chemische mutagenen, in het bijzonder, zijn nuttig als ze null, voorwaardelijke, hypomorphic (verminderde functie) te genereren en hypermorphic (gain of function) allelen. Met de komst van robuuste volgende generatie genoom-sequencing technologieën, kunnen dergelijke mutaties gemakkelijk worden geïdentificeerd en in kaart gebracht. Op deze wijze kan worden sterke associaties tussen veranderingen in een gen of genetische weg en een gemeenschappelijk fenotype, waardoor de toepassing van voorwaartse genetische methoden.

Het genoom sequenties van klinische stammen geopenbaard mosaicism bussen serovars en loci van frequente recombinatie (11). Empirisch bewijs voor recombinatie werd aangetoond door de co-infectie van twee verschillende antibiotica resistente stammen en selectie van dual resistente recombinant nageslacht, die werd geopenbaard aan genetische bijdragen van beide stammen (12, 13) hebben. Aldus genetische uitwisseling tussen wild type en mutante stammen in een co-infectie instelling maakt scheiding van chemisch-geïnduceerde mutaties op te sporen het aangetaste gen dat leidt tot de waargenomen fenotype.

Hier beschrijven we een werkwijze voor genetische analyse Chlamydia basis van chemische mutagenese, WGS en een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen (14) (fig. 1) uitvoeren.

Protocol

1. Chemische mutagenese Opmerking: We vonden dat de replicatieve vorm RB ontvankelijker voor chemische mutagenese dan de EB vorm. Midden in de cyclus (tussen de 18 tot 20 hpi), RBS zijn op de grootste aantallen voorafgaand aan RB-EB overgang. Omdat Chlamydia trachomatis is een obligaat intracellulair pathogeen, kunnen de effecten van de mutagene stof op de gezondheid gastheer bacteriën herstel beperken. Vero-cellen bleken beter bestand tegen de nadelige effecten van hoge niveaus van …

Representative Results

Blootstelling aan mutageen tot insluitsels die zonder bacteriën, waarschijnlijk als gevolg van bacteriële celdood verschijnen. Kenmerkend zal serovar LGV-L2 volledig lyseren geïnfecteerde cellen binnen 48 uur na infectie, maar behandeling met mutagene kan deze cyclus uitbreiden tot> 90 h. Ongeveer 10% van de insluitingen verwachting herstellen. In onze experimenten geïnfecteerde Vero cellen behandeld met 20 mg / ml EMS tot een afname 99% in de terugwinning van infectueuze nageslacht vergeleken met onbehandelde co…

Discussion

Deze methode voldoet aan de basiseisen voor genetische analyse als het vaststelt koppeling tussen genotypes en fenotypes. Belangrijk is dat deze wordt gerealiseerd zonder de hulp van conventionele moleculaire hulpmiddelen voor recombinant DNA transformatie en insertie inactivatie van genen in bacteriën, die vaak een snelheidsbeperkende stap in de analyse van genfunctie in non-model microben.

Een cruciale stap is om klonaliteit van plaque-gezuiverde mutanten te garanderen. Kruisbesmetting me…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS) Cellgro 35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS) Sigma M0880
Cyclohexamide Sigma C4859-1ML
Gentamicin Life Technologies 15750-060
Phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies 14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2) Life Technologies 14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate Sigma D7777
Nonessential amino acids (NEAA) Life Technologies 11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved Lonzo 50070
Genomic DNA purification kits Qiagen 69504
DNAzol Life Technologies 10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit) Invitrogen Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument Covaris

References

  1. Haggerty, C. L., et al. Risk of sequelae after Chlamydia trachomatis genital infection in women. J Infect Dis. 201, S134-S155 (2010).
  2. Dautry-Varsat, A., Subtil, A., Hackstadt, T. Recent insights into the mechanisms of Chlamydia entry. Cell Microbiol. 7 (12), 1714-1722 (2005).
  3. Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of Chlamydia trachomatis entry into nonphagocytic cells. Infect Immun. 75 (8), 3925-3934 (2007).
  4. Heuer, D., Kneip, C., Maurer, A. P., Meyer, T. F. Tackling the intractable – approaching the genetics of Chlamydiales. Int J Med Microbiol. 297 (7-8), 569-576 (2007).
  5. Stephens, R. S., et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans, Chlamydia trachomatis. Science. 282 (5389), 754-759 (1998).
  6. Thomson, N. R., et al. Chlamydia trachomatis, genome sequence analysis of lymphogranuloma venereum isolates. Genome Res. 18 (1), 161-171 (2008).
  7. Harris, S. R., et al. Whole-genome analysis of diverse Chlamydia trachomatis strains identifies phylogenetic relationships masked by current clinical typing. Nat Genet. 44 (4), 413-419 (2012).
  8. Somboonna, N., et al. Hypervirulent Chlamydia trachomatis clinical strain is a recombinant between lymphogranuloma venereum (L(2)) and D lineages. MBio. 2 (3), e00045-00011 (2011).
  9. Voigt, A., Schofl, G., Saluz, H. P. The Chlamydia psittaci genome, a comparative analysis of intracellular pathogens. PLoS One. 7 (4), e35097 (2012).
  10. Jeffrey, B. M., et al. Genome sequencing of recent clinical Chlamydia trachomatis strains identifies loci associated with tissue tropism and regions of apparent recombination. Infect Immun. 78 (6), 2544-2553 (2010).
  11. Gomes, J. P., et al. Evolution of Chlamydia trachomatis diversity occurs by widespread interstrain recombination involving hotspots. Genome Res. 17 (1), 50-60 (2007).
  12. DeMars, R., Weinfurter, J. Interstrain gene transfer in Chlamydia trachomatis in vitro, mechanism and significance. J Bacteriol. 190 (5), 1605-1614 (2008).
  13. Demars, R., Weinfurter, J., Guex, E., Lin, J., Potucek, Y. Lateral gene transfer in vitro in the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis. J Bacteriol. 189 (3), 991-1003 (2007).
  14. Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
  15. Tipples, G., McClarty, G. Isolation and initial characterization of a series of Chlamydia trachomatis isolates selected for hydroxyurea resistance by a stepwise procedure. J Bacteriol. 173 (16), 4932-4940 (1991).
  16. Wang, L. L., Henson, E., McClarty, G. Characterization of trimethoprim- and sulphisoxazole-resistant Chlamydia trachomatis. Mol Microbiol. 14 (2), 271-281 (1994).
  17. Scidmore, M. A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 11, Unit 11A 11 (2005).
  18. Li, H., Ruan, J., Durbin, R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores. Genome Res. 18 (11), 1851-1858 (2008).
  19. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  20. Suchland, R. J., Sandoz, K. M., Jeffrey, B. M., Stamm, W. E., Rockey, D. D. Horizontal transfer of tetracycline resistance among Chlamydia spp. in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 53 (11), 4604-4611 (2009).
  21. Sladek, F. M., Melian, A., Howard-Flanders, P. Incision by UvrABC excinuclease is a step in the path to mutagenesis by psoralen crosslinks in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (11), 3982-3986 (1989).
  22. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis, restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathog. 7 (9), e1002258 (2011).

Play Video

Cite This Article
Nguyen, B. D., Valdivia, R. H. Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (80), e50636, doi:10.3791/50636 (2013).

View Video