Summary

功能研究和过继转移实验小鼠骨髓嗜中性粒细胞的分离,纯化及贴标

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

我们描述了一个协议,用于分离和纯化从小鼠骨髓中的嗜中性粒细胞通过密度梯度离心和嗜中性粒细胞标记使用CellTracker染料。这是一个简单,快速,重复性好,经济的方法获得大量的嗜中性粒细胞的下游功能研究或过继转移和跟踪实验。

Abstract

嗜中性粒细胞是关键的先天免疫系统的效应细胞。他们正在迅速招募急性炎症部位,发挥保护或致病作用取决于炎症环境。然而,尽管中性粒细胞免疫力,详细了解调解中性粒细胞的效应,在不同的传染性疾病和炎症性疾病的免疫病理作用的分子因素,不可或缺的作用仍然缺乏,部分原因是由于其半衰期短,处理这些困难细胞和缺乏可靠的实验协议,获得足够数量的下游功能研究和中性粒细胞过继转移实验。因此,操作简单,快速,经济,可靠的方法是非常可取的收获足够数量的鼠标中性粒细胞的吞噬功能,杀灭,细胞因子的产生,脱粒和贩运等功能评估。为此目的,我们提出了可再现的密度梯度离心法为基础的协议,它可以适应于任何的实验室分离大量的中性粒细胞从小鼠骨髓中的具有高纯度和活力。此外,我们提出了一个简单的协议,使用CellTracker染料标记隔离中性粒细胞,然后可以过继转移到受体小鼠在一些组织和跟踪至少4个小时的转移后,使用流式细胞仪。使用这种方法,可以成功地采用了差异化标记的嗜中性粒细胞从野生型和基因缺陷小鼠不同CellTracker染料,执行竞争力的评价贩卖中性粒细胞从血液中特定基因的直接作用到在体内靶组织的再增殖研究。

Introduction

嗜中性粒细胞是人类最丰富的白细胞。他们是主要的先天免疫系统和抵御入侵的微生物的第一线作为细胞成分。获得性中性粒细胞减少症和原发性免疫缺陷的患者,影响中性粒细胞数量和/或功能的发展危及生命的侵袭性细菌和真菌感染,这些细胞在宿主防御1突出的重要性。在一场精心策划的先天免疫反应,从而导致分泌趋化因子产生趋化梯度能够招募中性粒细胞从血液中进入发炎组织2诱导其同源的模式识别受体的结果入侵的病原体在感染部位的免疫识别。中性粒细胞进入感染部位后,他们成为激活,导致细胞因子和趋化因子的生产,病原体吸收,并通过氧化和非氧化我杀chanisms 3。除了 ​​大家公认的先天免疫的作用,中性粒细胞也被最近表现出作为有效的适应性免疫反应的发起人,扮演着重要的角色。另一方面,从它们的免疫保护作用外,中性粒细胞也可介导组织损伤和由于过度积累和/或激活在炎症部位 ​​的免疫病理学,如图中的各种感染和自身免疫性疾病5-7。

尽管中性粒细胞在安装有效的先天免疫反应和一些传染性疾病和炎症性疾病,技术上的困难,处理这些细胞,并缺乏可靠的实验协议的多效性效应功能不可或缺的作用受阻的研究,在过去的几十年里,中性粒细胞。因此,应进一步促进使用可重复的检测,隔离中性粒细胞中性粒细胞介导的​​immunolo研究gical功能体外体内 。迄今为止,已经描述的几种方法已用于分离,如密度梯度离心的人血和小鼠血液或骨髓8,9,正极或负极的从小鼠血液或骨髓10,11中的嗜中性粒细胞的免疫磁性富集的嗜中性粒细胞,和收获巯基乙酸或其他抗炎剂12后,腹腔注射的小鼠的腹腔内中性粒细胞。虽然可以很容易地从人血中分离出大量中性粒细胞,这种方法是最理想的小鼠由于数量有限小鼠血液,排除隔离足够的中性粒细胞功能的研究或过继转移实验13。此外,虽然产量的巯基乙酸盐诱导的腹膜腔中的细胞相比,小鼠血嗜中性粒细胞在炎症腹腔灌洗,纯度之间变化60-90%,分离出的嗜中性粒细胞,表现出一个激活的表型。因此,收集的细胞用这种方法只能用于执行功能的激活的研究,但并不代表未受刺激的嗜中性粒细胞,小鼠腹膜腔有中性粒细胞数,在稳定状态12。相反,骨髓是一个方便的水库收获大量的任何未受刺激或激活的中性粒细胞11,14,它可以被用于下游功能性研究,如吞噬作用,杀害和脱颗粒,或过继转移到受体小鼠。

在这里,我们介绍一个简单而快速的协议(约2小时),它提供了一个高收益率(〜6-12×10 6中性粒细胞/未受感染的鼠标,或可达30-40×10 6中性粒细胞/感染小鼠)纯(80 -95%)嗜中性粒细胞> 95%的存活率,从骨髓。此方法使用市售HISTOPAQUE,密度梯度细胞分离配给介质组成的聚蔗糖和泛影葡胺钠,分离从小鼠骨髓中的嗜中性粒细胞。此方法产生的显着更大的每只小鼠的嗜中性粒细胞的数目相比,血液或腹膜腔,它可以被用来收集在稳定状态或感染后的小鼠嗜中性粒细胞,它是比较容易的层相比,使用不连续的密度梯度离心法Percoll密度梯度组成的55%/ 65%/ 75%的Percoll 9在PBS中。此外,收集纯净的中性粒细胞所需的时间和资源相比显着下降,中性粒细胞隔离,利用荧光激活细胞分选。此外,因为这种方法不涉及免疫磁性富集步骤,更具成本效益的,它避免了细胞暴露磁性柱和抗体,从而减少中性粒细胞活化的可能性。

在除了执行功能隔离neutroph研究中ILS 体外和细胞过继转移到受体小鼠,该协议还描述了一种方法,用于标识分离的嗜中性粒细胞,使用不同的CellTracker染料。从不同遗传背景的小鼠中性粒细胞的鉴别标签跟踪转移的嗜中性粒细胞在受体小鼠的组织,采用流式细胞仪,它可以提供机械洞察力贩运中性粒细胞从血液中特定基因的直接作用,可适应在竞争激烈的复育研究进入靶器官发炎6。

Protocol

1。小鼠骨髓细胞的分离安乐死小鼠使用该机构的动物保健委员会批准的协议,和动物表面喷用70%的乙醇。 在中腹部的皮肤做一个切口,去除皮肤的鼠标从远端部分包括下肢皮肤覆盖。 由下肢用剪刀切断肌肉和小心,同时避免破坏股骨头从髋关节脱位的髋臼。 取出剩余使用手术刀和剪刀从股骨和胫骨的肌肉和上面的膝关节多加小心,不破骨端部从胫骨股骨分离。放?…

Representative Results

这个协议被优化用于从小鼠骨髓细胞的收获和随后的分离的嗜中性粒细胞通过密度梯度离心使用市售HISTOPAQUE细胞分离介质从这些细胞。嗜中性粒细胞分离,使用这种方法可用于多种下游功能性研究体外受体小鼠过继转移实验中。 未受感染8-12周龄C57BL / 6小鼠双侧股骨和胫骨的骨髓细胞,每收集典型的产量为60-80万〜〜94-98%具有可行性细胞。下行密度梯度离心这些细胞?…

Discussion

在这里,我们提出了一个可靠,简单,快速,经济的协议,用于隔离大量嗜中性粒细胞从骨髓的小鼠具有纯度高,使用密度梯度离心法的可行性。 〜6-12×10 6中性粒细胞正确执行此协议,可以从收回未受感染的小鼠,从小鼠在感染后6和多达〜30-40×10 6中性粒细胞可能被孤立。分离出的嗜中性粒细胞是80-95%的纯> 95%是可行的。

骨髓是一种合适的水库…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作是支持该司院内研究的美国国家过敏和传染病研究所(NIAID),国立卫生研究院(NIH),美国。

所有小鼠均保持在美国协会认可的实验室动物护理动物设施在国家过敏和传染病研究所(NIAID)的评审,并根据实验室动物护理和使用指南中列出的程序安置在的主持下,由动物护理和使用委员会NIAID批准的协议。

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
      Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES Cellgro 10-041-CV  
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) GemCell 100500  
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140  
0.5 M EDTA Quality Biological Inc 351-027-101  
0.2% and 1.6% sodium chloride JT Baker 3624 Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077 Sigma 10771 Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119 Sigma 11191 Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium Cellgro 210-40-CV  
Ethyl Alcohol (200 proof) The Warner Graham Company 64-17-5  
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) Invitrogen C-7025 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) Invitrogen C-2927 Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) eBioscience 170451-82  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 551461  
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) BD Pharmingen 560599  
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) eBioscience 47-0112-82  
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) BD Pharmingen 553141 Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Molecular Probes L-23105 Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma 67-68-5  
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS USB Corporation 19943  
      Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
      Materials
C57BL/6 mice Taconic    
15 ml centrifuge tubes Corning 430053  
50 ml centrifuge tubes BD Falcon 352070  
25 ml serological pipettes Celltreat 229225B  
10 ml serological pipettes Celltreat 229210B  
5 ml serological pipettes Celltreat 229205B  
Pasteur pipettes (3 ml) BD Falcon 357575  
12 ml syringes Kendall monoject 512878  
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) BD 305122  
100 mm cell strainers BD Falcon 352360  
Bactericidal Petri dishes BD Falcon 351029  
Combitips Plus Biopur Eppendorf 2249608-5  
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) Biomedical Research Instruments 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 Instruments sterilized prior to use
      Equipment
Tissue culture hood The Baker Company SG403  
Refrigerated centrifuge Thermo Fischer Scientific 75004521  
37 °C shaking water bath Thermo Fischer Scientific 3166721  
      Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.

References

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Cite This Article
Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J. Vis. Exp. (77), e50586, doi:10.3791/50586 (2013).

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