Aqui, descrevemos um método robusto para o fraccionamento das membranas plasmáticas de plantas solúveis em membranas resistentes a detergente e do detergente baseado numa mistura de não marcado e in vivo totalmente 15 n marcadas culturas de células de Arabidopsis thaliana. O procedimento é aplicado para estudos de proteômica comparativas para compreender os processos de sinalização.
Microdomínios de membrana de plasma são características baseadas nas propriedades físicas do ambiente de lípido e de esteróis e tem funções particulares em processos de sinalização. Extraindo microdomínios de membrana enriquecidos com esteróis a partir de células de plantas para análise proteômica é uma tarefa difícil, devido principalmente a várias etapas de preparação e fontes de contaminação de outros compartimentos celulares. A membrana plasmática consiste apenas cerca de 5-20% de todas as membranas de uma célula de planta, e, por conseguinte, o isolamento da fracção de membrana de plasma altamente purificado é um desafio. Um método frequentemente utilizado envolve a partição aquosa em duas fases em polietileno-glicol e dextrano, que produz vesículas da membrana de plasma com um grau de pureza de 95% 1. Microdomínios membrana rica em esteróis na membrana plasmática são insolúveis mediante tratamento com detergentes não iónicos a frio a um pH alcalino. Esta fracção membranar resistente a detergente podem ser separados a partir da membrana do plasma por ultracentrifugação, em grandes quantidades, comogradiente ucrose 2. Subsequentemente, as proteínas podem ser extraídas a partir da banda de baixa densidade do gradiente de sacarose por precipitação de metanol / clorofórmio. Proteína extraída irá então ser digerido com tripsina, dessalinizada e finalmente analisadas por LC-MS/MS. Nosso protocolo de extração de microdomínios ricos em esteróis é otimizado para a preparação de frações de membrana detergente limpa-resistente de culturas de células de Arabidopsis thaliana.
Usamos a marcação metabólica completa de Arabidopsis thaliana as culturas de células em suspensão com K 15 NO 3 como a única fonte de nitrogénio para os estudos de proteómica comparativa quantitativa após o tratamento biológico de interesse 3. Ao misturar proporções iguais de culturas de células marcadas e não marcadas para extração de proteínas conjunta a influência de etapas de preparação no resultado quantitativo final é mantido a um mínimo. Além disso a perda de material durante a extracção vai afectar o controlo e as amostras de tratamento da mesma forma, umad por conseguinte, a proporção de luz e péptido alçada irá permanecer constante. No método proposto quer marcado ou não marcado de cultura de células é submetido a um tratamento biológico, enquanto a outra serve de controlo 4.
Em 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson propôs o modelo de mosaico fluido um modelo de estrutura das membranas celulares, substituindo o modelo sanduíche proteína-lipídio-proteína que foi geralmente aceite no início de 1960. Singer e Nicolson postulado que a membrana biológica pode ser considerada como um líquido bidimensional em que todas as moléculas de lípidos e de proteínas difundem-se livremente e facilmente 5. Desde essa altura, o modelo de estrutura da membrana do plasma e do conhecimento da composição de membrana tornaram-se ainda mais complexo. Particularmente, dentro da membrana do plasma, tais como estruturas de complexos de proteínas e de lípidos com base / esterol microdomínios estruturalmente desordenados pode ser observada. Em membranas modelo artificiais 6,7, esteróis e sphingolipids pode lateralmente segregar de outras espécies de lipídios para formar regiões com características físicas alteradas. Esta segregação no interior da membrana celular é causada principalmente pelas propriedades de auto-associação entre esteróis e altamente sacadeias de hidrocarbonetos de turated phopsho-esfingolípidos e 8. Particularmente, os anéis de esteróis rígidas favorecem as interações com mais aguerrida e espécies de lipídios reto saturadas e essas interações forçar vizinhos cadeias de hidrocarbonetos em mais conformações prolongadas, aumento da espessura da membrana e dureza.
Uma das características comumente observados de esterol enriquecido microdomínios membrana era a sua insolubilidade no tratamento com detergentes não-iónicos de Triton X-100 ou como Brij 35. Essas frações foram pensados para ser idêntico ao microdomínios de membrana e foram chamados de membranas resistentes detergente (DRM) com base em seu método de preparação bioquímica 2. O uso de detergentes não iônicos durante a extração DRM recebeu algumas críticas como a preparação DRM bioquímico podem não corresponder diretamente a qualquer compartimento de membrana específico dentro da célula viva 9. Particularmente, a proporção de detergente para a proteína parece ser essencial em tais preparações, umas diferentes detergentes, bem como diferentes quantidades de detergentes pode produzir diferente composição da fracção de membrana resistente a detergente 10. No entanto, há evidências de que certas espécies de proteína associar especificamente com esses domínios de membrana rica em esteróis celulares, e que estas proteínas são bem enriquecido em preparações bioquímicos das fracções de membrana resistente a detergente 11. O núcleo de proteínas que foram encontrados na fracção DRM planta, e para as quais a presença de DRM foi esterol dependente, eram particularmente proteínas ancoradas por GPI, tais como proteínas, como a fasciclina-arabinogalactano (AVL) e membros da família de proteínas de SKU. Além disso, algumas proteínas sinalizadoras, como quinases ou fosfolipases receptores do tipo foram encontrados 11. Estes resultados são consistentes com vários estudos de proteômica em microdomínios de membrana de mamíferos 12,13. Também em plantas há cada vez mais evidências para o papel de microdomínios de membrana no contexto da resposta ao estresse 14 –16.
O protocolo aqui descrito proporciona um método robusto para fraccionamento de microdomínios da membrana do plasma e em particular utiliza uma proteína com a concentração de detergente que permite descrever as alterações induzidas pelo stress do compartimento da membrana rica em esteróis 4,11,14.
O protocolo apresentado neste artigo contém muitas etapas e todos eles são cruciais para a obtenção de fracionamento pura e representante da membrana plasmática da planta em membranas resistentes detergente e frações solúveis detergentes. Portanto, é importante seguir cada passo as instruções.
O tratamento da fracção da membrana de plasma com um detergente não-iónico (passo 3.2) tem a maior influência sobre a qualidade da membrana microdomínio fraccionamento. Para obter resu…
The authors have nothing to disclose.
REAGENTS | |||
Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
Trypsin | Promega | V5113 | |
Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
EQUIPMENT | |||
Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
Plate reader | BioTek | ||
EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
Thermomixer | Eppendorf | ||
Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
Shaker Unimax 2010 | Heidolph |