Visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de SOX10: kaede transgene zebravis Line Met behulp van Time-lapse confocale microscopie
Summary
Visualisatie van experimentele gegevens is uitgegroeid tot een belangrijk element in de presentatie van de resultaten aan de wetenschappelijke gemeenschap. Generatie van de live time-lapse opname van groeiende embryo draagt bij aan een betere presentatie en begrip van complexe ontwikkelingsprocessen. Dit protocol is een stap-voor-stap handleiding voor cel etikettering via photoconversion van kaede eiwit in de zebravis.
Abstract
Gewervelde palatogenesis is een zeer choreografie en complexe ontwikkelingsproces, waarin migratie van craniale neurale lijst (CNC) cellen, convergentie en uitbreiding van het gezicht uitsteeksels, en rijping van het craniofaciale skelet gaat. Kaede transgene zebravis lijn werd gegenereerd: de bijdrage van de craniale neurale lijst aan specifieke regio's van de zebravis gehemelte een SOX10 bestuderen. SOX10 biedt lineage beperking van de kaede reporter eiwit aan de neurale lijst, waardoor de cel etikettering een nauwkeuriger proces dan traditionele kleurstof of reporter mRNA injectie. Kaede is een foto-cabriolet eiwit dat verandert van groen naar rood na foto-activering en maakt het mogelijk om cellen precies te volgen. De SOX10: kaede transgene lijn werd gebruikt om lineage analyse uit te voeren om CNC celpopulaties die aanleiding geven tot de bovenkaak versus onderkaak elementen en illustreren homologie van het gezicht uitsteeksels aan amniotes bakenen. Dit protocol beschrijft de staps om een live time-lapse video van een SOX10 genereren: kaede zebravis embryo. Ontwikkeling van de ethmoid plaat zal dienen als een praktisch voorbeeld. Dit protocol kan worden toegepast op het maken van een time-lapse confocale opnemen van welke kaede of soortgelijke photoconvertible reportergen in transgene zebravis. Bovendien kan het worden gebruikt om niet alleen normaal, maar ook abnormale ontwikkeling van craniofaciale structuren in de zebravismutanten vangen.
Introduction
Orofaciale kloven vormen de meest voorkomende craniofaciale misvorming, met 1/700-1, 000 leveringen getroffen 1. Verstoring van de vroege embryonale craniofaciale ontwikkeling kan leiden tot de vorming van gespleten lip en gehemelte (CL / P). Terwijl oorzaken voor syndromic gespleten grotendeels zijn aangetoond, de genetische en epigenetische basis van niet-syndromale vormen van orofaciale clefting moeten nog worden ontdekt 2-4. Om de etiologie en pathogenese van deze misvormingen te begrijpen, is het noodzakelijk de ontwikkeling van craniofaciale structuren op cellulaire basis helderen.
In alle gewervelde diersoorten craniale neurale lijst cellen (CNCC) migreren van de dorsale neurale buis naar de pharynxbogen, die zullen bijdragen tot de vorming van orofaciale structuren bevolken. Verstoring van de vroege embryonale neurale ontwikkeling kan leiden tot de vorming van craniofaciale misvormingen, waaronder CL / P 5-7.
In de advoorwaarde om structurele overeenkomsten tussen zebravis en zoogdieren craniofaciale ontwikkeling (CNCCs in homologe gebieden wonen), wordt het gen regulerende netwerk sterk geconserveerd. Ook is aangetoond dat CNCCs ontwikkelen op dezelfde wijze tussen amniote soorten en zebravis 8, waardoor de zebravis een krachtige organisme voor de studie van ontwikkeling en genetische basis van CL / P. Het heeft vele voordelen, met inbegrip van kleine omvang, snelle en ex-utero embryonale ontwikkeling, en een hoge fokkerij tarieven. Bovendien is het embryo optisch transparant, waardoor het vatbaar voor observatie van complexe ontwikkelingsgebeurtenissen onder de microscoop 9. Het is een ideale diermodel voor de studie van migratie en differentiatie van craniale neurale cellen.
Voortbouwend op eerder gepubliceerd werk 8, 10, 11, de trekkende patroon van CNCC werd in detail beschreven met behulp van de SOX10: kaede transgene model 5. Kaede is een foto-cabriolet eiwit dat turns van groen naar rood na foto-activering en maakt het mogelijk CNCCs nauwkeurig traceren. Gedurende deze transformatie de peptide hoofdketen wordt gesplitst, wat suggereert dat de conversie stabiel, waardoor de cellen kunnen worden gevolgd op hun eindbestemming 12. Transgene lijnen gelabeld met kaede onder transcriptionele controle van SOX10 bleek dat de amniote gehemelte en zeefbeen plaat van zebravis homoloog zijn gevormd door fusie van bilaterale bovenkaak uitsteeksels (MXP) met frontonasal bekendheid (FNP) en de Y-vormige fusie naad tussen analoog species.
Onder andere toepassingen, de SOX10: kaede transgene zebravis als model werd gebruikt om video's van de zebravis embryo's te genereren in verschillende ontwikkelingsstadia van de vorming van normale en abnormale craniofaciale structuren tonen. Photoconversion specifieke groepen cellen maakt het mogelijk om de ontwikkeling te volgen. Met deze methode een aanpak om live beeldvorming van het ontwikkelen craniofac creërenial structuren in de zebravis wordt geïntroduceerd, waardoor het gemakkelijk is om visueel te tonen dit complex ontwikkelingsproces.
Dit protocol is gericht op het delen van de ervaring van het genereren van deze video's met behulp van de normale ontwikkeling van de ethmoid plaat in SOX10: kaede transgene zebravis als voorbeeld. Dit protocol kan verder worden toegepast op het maken van time-lapse video van een structuur afgeleid van craniale neurale cellen in de zebravis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een nieuwe werkwijze voor visualisatie van craniofaciale ontwikkeling in de zebravis model weergegeven. De SOX10: kaede transgene zebravis lijn is met succes gebruikt om de migratie patroon van CNCC in detail te beschrijven wordt gebruikt als modelorganisme 5.
Eerdere studies hebben bruto bezienswaardigheden, zoals het oog gebruikt om cellen te richten en hebben vertrouwd op kaede mRNA injectie, photoconversion assays of gekooide fluoresceïne dextran voor photoconversi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Robert Kelsh voor vriendelijk delen van de zebravis SOX10 promotor reagens.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| sox10: kaede transgenic zebrafish line | MGH | Available via the Liao lab | |
| Petri dishes 100×15 mm | BD Falcon | 351029 | |
| Petri dishes 35 mmx10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose | Invitrogen | 15517022 | |
| Lab Tek 2 Chamber SlideSystem | LabTek | 154453 | |
| Microloaders 200/pk | Fisher | E5242956003 | |
| Nikon A1R Si Confocal Ti series | Nikon | No Catalog number | |
| NIS Elements Software AR3.2 64-bit | Nikon | No Catalog number |
References
- . Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
- Dixon, M. J., et al. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
- Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting. Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).
- Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton. Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).
- Dougherty, M., et al. Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model. J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).
- Trainor, P. A., Krumlauf, R. Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo. Development. 120 (3), 483-494 (1994).
- Swartz, M. E., et al. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
- McCollum, C. W., et al. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).
- Eberhart, J. K., et al. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).
- Ando, R., et al. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Kimmel, C. B., et al. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).
- Kawakami, A., et al. The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling. Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development. J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).
