Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные белки, которые кодируют как GTPase и киназные домены и которые фосфорилируется в клетках. Здесь мы приводим протокол маркировать LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения их общий уровень сотовой phophorylation.
Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются паралоги, которые разделяют подобную организацию домена, в том числе серин-треонин домена киназы, в Ras из комплексной области белков (РПЦ), С-терминала РПЦ домена (COR), и лейцин-богатый и анкириновых, как повторяется на N-конце. Точные сотовой роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как LRRK2 вовлечен в патогенез болезни Паркинсона 3,4. В этом отчете мы приводим протокол маркировать белки LRRK1 и LRRK2 в клетках с 32 P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения общего уровня фосфорилирования этих 2 белков в клетках. Короче говоря, близость отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками после лишь немногиеч инкубации и все молекулы в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Через аффинной метки (3xflag) в LRRK белки изолированы от других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Протокол может быть легко адаптированы дл контрол фосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации.
Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные паралоги, которые разделяют подобную организацию домена. Оба белка кодирования последовательность GTPase сродни семьи Рас из GTPases (Ras сложных белков, или РПЦ), а также С-концу РПЦ домена (COR), эффективно классификации оба белка в семье 5,6 ROCO белка. N-терминал доменного тандеме РПЦ-COR, оба белка кодировать лейцин-богатый повтор домен, а также в анкириновых-подобный домен, в то время как только LRRK2 кодирует дополнительный броненосца Domein 6-8. С-конец РПЦ-COR, оба белка поделиться домен киназы серин-треонин в то время как только LRRK2 кодирует домен WD40 в С-концевой области 8. Точные сотовые роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации 1,2, в то время как генетическая данные указывают на роли LRRK2 в патогенезе болезни Паркинсона 3,4.
<pкласс = "jove_content"> фосфорилирования белков является общей механизм регулирования в клетках. Например, фосфорилирование может быть существенным для активации ферментов или для набора белков в комплексе сигнализации. Клеточный фосфорилирование LRRK2 широко характеризуется и отображение phosphosite показал большинство сотовой сайтов фосфорилирования произойти в кластере между повторения анкириновых и богатых лейцином повторных областей 9-11. Хотя LRRK1 сотовой сайты фосфорилирования до сих пор не отображается, данные исследований с использованием фосфопротеин окрашивание блотов иммунопреципитации белка LRRK1 от COS7 клеток показывает, что LRRK1 белок фосфорилируется в клетках 12.Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK PROTEмодули выражены в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей 32 P-ортофосфат. 32 Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией (32 P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс.
Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с 32 P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подв…
The authors have nothing to disclose.
Мы также благодарны Майкл Дж. Фокс Фонд в поддержку этого исследования. Мы благодарим исследовательский фонд – Фландрия FWO (проект FWO G.0666.09, старший научный сотрудник общение на JMT), проект Нейро-TARGET ВВТ SBO/80020, Ку-Левен (OT/08/052A и IOF-KP/07 / 001) за их поддержку. Это исследование было также частично поддержана Фондом Druwé-Eerdekens управляемых Фонд короля Бодуэна в JMT.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11971-025 | This medium contains no phosphates |
Anti Flag M2 affiinty gel | Sigma | A2220 | For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426. |
Extra thick blotting filter | Bio-Rad | 1703965 | |
Ponceau S solution | Sigma | P7170 |