Аденовирусные перенос гена в наивных CD4 Т-клеток с трансгенной экспрессии рецептора аденовируса Коксаки позволяет молекулярного анализа регуляторных Т-клеточной дифференцировки<em> В пробирке</em>.
Регуляторные Т-клетки (Treg,) имеют важное значение для обеспечивать иммунную толерантность к себе, а также определенные чужеродные антигены. Tregs могут быть получены от наивных Т клеток CD4 в пробирке с TCR-и совместной стимуляции в присутствии TGF-и ИЛ-2. Это имеет огромный потенциал для будущих терапий, однако, молекулы и сигнальных путей, которые контролируют дифференциации в значительной степени неизвестными.
Первичные Т-клетки можно манипулировать посредством эктопической экспрессии генов, но общие методы не позволяют нацелены на наиболее важных наивных состояние Т-клеток перед первичным распознавание антигена. Здесь мы предоставляем протокол выразить внематочной генов в наивных Т клеток CD4 в пробирке Перед тем как вызвать Treg дифференциации. Это относится трансдукции репликацию аденовируса-дефицитных и объясняет его поколения и производства. Аденовирус может занять до больших вставками (до 7 КБ) и может быть оборудован с промоутерами для достижения высоких и переходные ПЕРЕЭКСПression в Т-клетках. Он эффективно преобразовывает наивные Т-клетки мыши, если они выражают трансгенных аденовирус Коксаки рецепторов (CAR). Важно отметить, что после инфекции Т-клеток остаются наивных (CD44 низкий, CD62L высокий) и отдыха (CD25 -, CD69 -) и может быть активирована и дифференцировались в Tregs похожа на неинфицированных клеток. Таким образом, этот метод позволяет манипуляции дифференциации CD4 Т-клеток с самого начала. Это гарантирует, что эктопическая экспрессия гена уже на месте, когда в начале сигнальных событий начальной стимуляции TCR вызывает клеточный изменения, которые в конечном итоге ведут в Treg дифференциации.
Tregs имеют решающее значение для поддержания иммунной толерантности и, чтобы ослабить превышение иммунных реакций. Tregs подавлять наблюдателем активацию Т-клеток. Следовательно, абляция Tregs приводит к фатальным аутоиммунные и самоуничтожение обусловлен активированных Т-клеток 1. Tregs развиваться в тимусе при отрицательной селекции клеток CD4 одним положительным предшественников, но они также могут дифференцироваться в периферии от наивных CD4 Т-клеток при низких дозах антигена стимуляции с субоптимальной костимуляцию 1,2. Тимуса Tregs кажется подавить ткани аутоиммунные против аутоантигенов, в то время как периферийная Tregs были вовлечены в обеспечении толерантности в кишки или легкого. Эти индуцированные Tregs мощно предотвратить активацию Т-клеток после признания чужеродных антигенов в слизистой оболочке, в том числе экологических антигенов из пищи и воздуха, синантропных бактерий и аллергенов 3,4. Кроме того, Tregs имеют решающее значение для создания материнской толерантности к плода пептиды 5 и предварительновентиляционные трансплантат против хозяина 6. В то же время, Tregs также посредником нежелательных эффектов путем ослабления иммунного надзора опухолевых клеток 7,8. Отличительной особенностью Tregs является выражением подмножество указанием Foxp3-фактор транскрипции, вилка-головной домен-содержащий транскрипционный фактор, который является необходимым и достаточным для придания Treg функции 9,10. Некоторые сигнальных путей, которые могут индуцировать Foxp3 экспрессии, хорошо известны. Однако молекулярные процессы, контроля, регулирования, или модулировать Treg дифференцировка на Т-клеточный рецептор запуска менее понятны.
Tregs может быть очень эффективно индуцированных в пробирке посредством стимуляции наивным Т-клеток CD4 анти-CD3 и анти-CD28 антитела в присутствии TGF-и ИЛ-2 11. Поскольку новые Tregs функциональны в естественных условиях, манипулирование молекулами, которые способствуют Treg дифференциации несет огромный потенциал для будущего therapiы, например, при лечении астмы, болезни Крона, и трансплантации 11,12. С другой стороны, терапевтическое модуляции молекул блокировать Treg дифференциации может принести пользу в будущем подходы комбинированного лечения онкологических больных.
В анализах пробирке дифференциации играют важную роль для описания молекулярных изменений, которые связаны с Т дифференциации подмножество клетки. На данный момент экспериментальные попытки поиска или экран для генных продуктов, которые контролируют дифференцировки Т-клеток препятствует тот факт, что наиболее распространенными методами эктопической экспрессии гена неудачу в наивных Т-клеток. Например, электропорации и ретровирусной трансдукции эффективны только в активированных Т-клеток. В отличие от первоначальных ожиданий, лентивирусов трансдукции, которое обычно эффективны в покоящихся клеток, требует предварительной активации наивных Т-клеток цитокинами 13. Кроме того, передача кДНК или мРНК во время электропорациивключает деполяризацию мембраны плазмы, которая сама дает особенности активации Т-клеток и может даже мобилизации Са 2 + сигналов и активировать NFAT белков (неопубликованные наблюдения и реф. 14). Аналогично, для ретровирусов трансдукции, наивные Т-клетки должны быть активированы в течение 18 – 40 часов. В течение этого времени распада ядерной мембраны в процессе клеточного деления происходит и позволяет последующей интеграции геномной ретровирусный вектор 15. Эти методы являются, следовательно, не в состоянии решать начале молекулярный регулирование начальной Т встречи клетки с антигеном, который является решающей фазе помощник дифференцировки Т-клеток.
Аденовирусной трансдукции, как известно, придают переходных эктопической экспрессии гена в ряде типов клеток человека, которые экспрессируют человеческий рецептор аденовируса Коксаки (CAR). Это продолжается без требования для активации клеток или клеточного цикла. Поверхностную экспрессию CAR необходимо эффективное присоединение вируса и интернализации и трансгенной экспрессии усеченной версии CARΔ1 под Т-клеток промотора было установлено, оказывают мышь тимоцитов и Т-клетки, восприимчивыми к аденовирусной инфекции 16. Важно отметить, что трансгенов не изменяет тимоцитов развития или в пробирке дифференцировки наивных CD4 Т-клеток в различные подмножества (данные не приводятся; ссылка 17.). Аденовирус трансдукции Т-клеток был ранее использован для сверхэкспрессию 17,18 и нокдауна подходы 19,20. Трансгенных клеток T может быть очищен из коммерчески доступных DO11.10 ТГ; CARΔ1 ТГ (Taconic, Inc и ссылка 17.). Важно отметить, что аденовирусной трансдукции позволяет с высокой экспрессией гена интереса к наивным Т-клеткам, не вызывая очевидных признаков активации. Т-клетки остаются наивными (CD44 низкий, CD62L высокий) и отдыха (CD25 -, CD69 -) после Infectiна и может быть активирована и дифференцировались в Treg похожа на неинфицированных клеток.
Получение рекомбинантных аденовирусов может быть достигнута после трансфекции клетки HEK293A с аденовирусной плазмиды (фиг. 1). Эти плазмиды обычно содержат человеческий тип 5 геном аденовируса с E1 и E3 генов удален оказывать рекомбинантных аденовирусов репликации некомпетентные 21. HEK293A клетки дополняют репликации дефицита, как они были увековечены через стабильной интеграции стриженого аденовирус 22. С аденовирусных векторов большие (~ 40 Kb) и, следовательно, не очень хорошо подходит для традиционных ферментов рестрикции-опосредованной клонирование, мы использовали шлюза системы. Интерес ген первоначально клонировали в меньший входной вектор, из которого можно легко переносить в аденовирусный вектор назначения через лямбда реакции рекомбинации (LR) 23. Мы построили pCAGAdDu векторпутем объединения CAG промотор (курица промотор актина и энхансер CMV) счет экспрессирующей кассеты, содержащей LR сайтов, фланкирующих прокариотических выбор CCDB маркер 24. Эта кассета экспрессии слитого с внутреннего входа рибосом (IRES) элемент, который позволяет совместной экспрессии эукариотических инфекции маркер усиленный зеленый флуоресцентный белок (УЗФБ), которые слиты с последовательностью, содержащей бычьего гормона роста поли (А)-сигнала. Мы выбрали CAG цис-регуляторных последовательностей, так как прототип промотор CMV было обнаружено, что чрезвычайно-зависимой активации и, следовательно, неблагоприятных для экспрессии генов в наивным Т-клеток.
Здесь мы приводим протокол для эффективной дифференциации в пробирке Treg и способу для трансдукции наивных CD4 Т-клеток без активации (фиг. 2). Метод позволяет эктопическая экспрессия гена или сбить предыдущего CD4 Т-клеток в наивной государства. Это позволяет тестирования эффекта overexpresseD интересующего гена в раннем сигнальных событий при первоначальной стимуляции TCR до T приверженность подмножество клетки. Наши эксперименты проверки также обеспечивают основу для создания аналогичных приложений аденовирус в дифференцировке клетки других подмножеств T, таких как Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, или TFH клеток.
Поколение Вирус и титрование
Для получения оптимальных результатов трансфекции, качество и количество векторных линеаризованной представляются наиболее важными. Мы не наблюдали негативных последствий от производства сырья лизат из начальных разрастание культуры с ин…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Lirui Du построения pCAGAdDU вектора и Оливер Горка для обеспечения фиксации протокола.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
PacI | New England Biolabs | R057S |
jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
A549 | ATCC | CCL-185 |
6-well plates | BD Falcon | 353046 |
14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |