Summary

活用<em生体内で></em新生児の実験マウスサイトメガロウイルス感染の進行を監視する>イメージング

Published: July 06, 2013
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Summary

新生児のヒトサイトメガロウイルス(HCMV)感染症は、精神遅滞の重要な原因を表し、まだウイルス誘発病因につながる分子事象はまだよく理解されていない。脳の感染症のダイナミクスを調べるために、我々は全体の動物の適応<em生体内で></em>イメージングルシフェラーゼ組換えウイルスに感染した新生児の経時的分析を実行する。

Abstract

ヒトサイトメガロウイルス(HCMVまたはHHV-5)は、免疫低下個体における生命を脅かす病原体である。先天性または新生児感染すると、ウイルスが難聴と精神遅滞を含む重篤な神経学的損傷を誘発する可能性がある、発達中の脳に感染し、複製することができます。症状の潜在的な重症度にもかかわらず、治療の選択肢は、ワクチンと特定抗ウイルス療法の有無を利用できないことによって制限されます。観測は主に感染した子供の剖検に由来するため、また、中枢神経系(CNS)の感染の間に発生する分子事象の正確な記述がまだ欠けている。このようなアカゲザルCMVなどのいくつかの動物モデルは、CNSにCMVの病因に重要な洞察力を開発し、提供されている。しかし、人間とその進化の接近にもかかわらず、このモデルは動物や短所を感染させるために使用頭蓋内接種法によって制限されていたistently CNSの感染症を誘発する。さらに、倫理的配慮は、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)と生まれたばかりのマウスの新生児の感染は、最近大きな進歩につながっている、そのうち、別のモデルの開発を推進してきました。例えば、それをBalb / cの新生児にMCMVを腹腔内注射は、脳の特定の領域におけるニューロンおよびグリア細胞の感染をもたらすことが報告された。これらの知見は、マウスの実験的な接種が子供でHCMV感染によって誘導される赤字を繰り返す可能性が示唆された。それにもかかわらず、新生児のMCMV感染の動的解析は、古典的な手法は、ウイルス負荷および/または免疫関連のパラメータを分析するために異なる時点で動物はかなりの数の犠牲を必要とするため行うことは困難である。このボトルネックを回避するために、希少変異動物の将来の調査を可能にするために、我々はビラの経時的解析を実行する生体内画像化技術適用C57BL / 6新生児にルシフェラーゼを発現する組換えMCMVの末梢注射時の脳内リットル普及。

Introduction

ヒトサイトメガロウイルス(HCMV/HHV-5)は、β-ヘルペスウイルスファミリーのメンバーである。 HCMVは、通常、無症候性感染1は早く生命の間に取得された高度に普及している、日和見病原体である。すべてのヘルペスウイルスと同様に、HCMVは、免疫システムしっかりウイルス複製を制御するホストの全生涯にわたって持続します。ウイルスの再活性化のエピソードはほとんど移植患者は、移植片拒絶反応2を防ぐために薬を受け取るなど、免疫不全の人に起こる。成人では、HCMVも神経膠芽腫3にリンクされています。さらに、HCMVは未熟免疫4-6と新生児のための著名な病原体である。発達中の胎児や新生児に初感染は深刻な結果を持つことができます。 HCMV感染症は先進国では先天性先天性欠損症と小児疾患の最も一般的な感染原因となっています。なお、新生児HCMV感染症の発生率は0.5から1パーセントプレーヤーに影響を及ぼしていると推定されるfは5〜10%がこのような小頭症や小脳の形成不全などの重篤な症状に悩まされますそのうち全て出生。また、無症候性ウイルス感染と感染児の10%が後損失、視覚的な欠陥や発作、てんかん7,8を聞い 、精神遅滞につながる後遺症を開発する。

として注射9の異なる経路を経由してマウスに接種することができるような単純ヘルペス1(HSV-1/HHV-1)などの他のヒトヘルペスウイルスとは対照的に、サイトメガロウイルスの複製は種特異的である。この機能は、厳しくHCMVの異なる動物モデルで行われ病因(マウス、ラット、モルモット、アカゲザル)とそれぞれの本物のホスト固有CMVsの調査を妨げている。すべてCMVsは、ゲノムサイズと組織、組織親和性および遺伝子発現の調節の有意な類似性を示す。彼らはまた、それぞれのホストで同じような病態を引き起こす。ゲノムの多様性にもかかわらずであるトゥイーンHCMVおよびマウスサイトメガロウイルス(MCMV)(ORFの50%マウスCMVにおいて識別されるヒトウイルス中に存在する)は、マウスモデルは、最近ほとんど変異株は、ウイルスを制御する能力について試験することができるので、有利であることが証明されているin vivoでの複製。これは、このウイルスは、10〜 "resistome"を構成する成虫期で発現するマウス遺伝子の数の推定を可能遺伝学的スクリーニングにつながっている。要するに、これは、MCMV-感染マウスは、成人におけるホストウイルスの相互作用の研究のための魅力的なモデルを表して示している。人間とマウスの間に胎盤層組織の違いは、マウスにおけるウイルス感染の母に胎児伝送を損なうため、先天性CMV感染症の調査はより複雑です。最近では、妊娠12.5日に胎盤におけるMCMVの直接注入は、減損11聴力につながったマウス新生児の脳の感染を可能にしました。しかし、ほとんどの一nvestigationsは現在、潜在的に血行性脳の感染症につながる全身ウイルス普及、頭蓋内注射に比べてより関連性のあるモデルを提供するために4-20 HR-古い新生児の腹腔内注射を使用しています。このプロトコルは、CMVの病因に重要な洞察を提供し、より具体的には、マクロファージ12のような単核細胞で浸潤される炎症病巣部に位置ニューロンおよびグリア細胞におけるウイルス複製における新生児の結果とMCMV感染を実証した。このレポートには、減少粒状ニューロンの増殖と遊走と複数インターフェロン刺激遺伝子の誘導を伴う小脳の変化した形態形成を説明しました。中枢神経系におけるMCMVを制御するためのCD8 + T細胞の本質的な役割についても同じグループ13によって報告された。微生物の病理学的効果を分析する際に考慮すべき重要な側面は、感染のダイナミクスですイオン。 MCMVの場合には、将来の神経生物学的傷害の大きさを理解し、予測するために、発達中の脳へのウイルス伝播の進行を探索し、定量化することが特に重要である。伝統的に、感染の進行の定量化は、感染した動物の定期的な犠牲を、そうでなければアクセスできない脳などの組織中の病原体を、滴定する必要があります。プロトコルのこのタイプは、今必要な動物福祉の向上と3Rの(交換して、絞込み、リデュース)原則14によって挑戦されています。 生体内画像化技術において使用したインビボの感染実験において必要とされる動物の数の大幅な削減を可能にすることができる。ここでは、報告し、マウス新生児への腹腔内MCMVリュック·注入時に脳内にウイルスの普及の経時的分析について説明します。同じ動物を使用して、我々は強烈なVIのサイトを追跡し、 生体内で監視2週間の期間中にRAL複製。

Protocol

1。ウイルス懸濁液の調製ウルリッヒKoszninowskiの研究室からMCMV表現ルシフェラーゼのスミス株(MCMVリュック·15)を入手します。この組換え体では、ルシフェラーゼ遺伝子がゲノムのMCMV IE2遺伝子座に挿入されている。 MCMV-リュックを増幅するために、16(MOI、0.001〜1)感染症の異なる多重度MCMVとマウス骨髄ストローマ細胞株(M2-10B4、ATCC#CRL-1972)を感?…

Representative Results

代表的な実験は、 図1に示されている。 MCMV-リュックの50 PFUs(パネル針の皮下経路を可視化するためにメチレンブルーで行われた同様の注射を示しています)の腹腔内注射すると、新生児は麻酔し、同時にルシフェラーゼ基質(ルシフェリン、キャリパー)0.3mgのを受けた。 15分後、動物をIVIS 50の取得室(生体イメージングシステムでは、キャリパー)の腹側を上にして配置さ?…

Discussion

マウス新生児にMCMV-リュックの普及を監視する生体イメージング技術使用して、我々は、野生型とは対照的に、変異動物の脳にウイルスの拡散を観察することができました。脳の動物とex vivoイメージングのさらなる切開は、中枢神経系における発光ウイルスの存在を確認した。さらに、我々はまた、MCMV E1初期タンパク質に特異的な抗体と脳薄切片上(図示せず)免疫組…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、ウイルス学研究所の動物施設を使用するための許可をMCMV·リュックとトーマスBaumert(INSERM U748、ストラスブール)を増幅し、滴定のためにリーTuddenham(IBMC、ストラスブール)に感謝。 INSERM、大学·デ·ストラスブールと通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ(ANR-08-MIEN-005-01)からの財政支援が認められている。彼らのマスタープロジェクト間にソニアBeroudとレティシアLelieurの初期の参加も認められている。

Materials

Reagent/Material
DMEM Fisher Scientific W3523A
Methylene blue Sigma Aldrich 319112
Insulin needles VWR 613-4897
Ketamine CentraVet Ket 201
Xylazine/Vetranal Sigma Aldrich 46995
DPBS DUTSCHER P0436500
Luciferin Caliper 760504
gentamycin Sigma Aldrich G1272
penicillin/streptomycin Gibco 15070
carboxymethylcellulose Sigma Aldrich C4888
formaldehyde Sigma Aldrich F8775
crystal violet Sigma Aldrich C3886
Equipment
IVIS 50 Caliper/Perkin Elmer

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Cite This Article
Ostermann, E., Macquin, C., Bahram, S., Georgel, P. Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates. J. Vis. Exp. (77), e50409, doi:10.3791/50409 (2013).

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