Qui si descrive un protocollo per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B dal sangue del cordone ombelicale. Una sufficiente quantità e qualità di acidi nucleici può essere estratto dalle cellule e utilizzati in saggi successivi utilizzando DNA o RNA.
Il sangue del cordone ombelicale è altamente arricchito per le cellule progenitrici ematopoietiche in fasi diverse di impegno lignaggio. Abbiamo sviluppato un protocollo per isolare precursori delle cellule B in quattro diversi stadi di differenziazione. Poiché i geni sono espressi e modificazioni epigenetiche verificarsi in modo tessuto-specifico, è fondamentale per discriminare tra tessuti e tipi di cellule, al fine di essere in grado di identificare le alterazioni nel genoma e dell'epigenoma che può portare allo sviluppo della malattia. Questo metodo può essere adattata a qualsiasi tipo di cellula presente nel sangue del cordone ombelicale in qualsiasi fase di differenziazione.
Questo metodo si compone di 4 fasi principali. Primo, le cellule mononucleari sono separate mediante centrifugazione densità. Secondo, le cellule B sono arricchiti con anticorpi coniugati biotina che riconoscono e rimuovere le cellule B non dalle cellule mononucleari. Terzo le cellule B sono fluorescenti marcate con anticorpi di superficie cellulare di proteine specifiche per singole fasidi sviluppo delle cellule B. Infine, le cellule sono ordinati contrassegnati in modo fluorescente e singole popolazioni sono recuperati. Le cellule recuperate sono in quantità e qualità sufficiente per essere utilizzato in saggi di acido nucleico a valle.
Al fine di identificare aberrazioni che sono presenti nella malattia, è di fondamentale importanza che usiamo tessuti sani o cellule che corrispondono al tipo di tessuto o cellule colpite dalla malattia. Una ragione di ciò è che la variazione epigenetica tra tipi di tessuto è responsabile della regolazione dell'espressione genica ed è fondamentale per la differenziazione cellulare durante il normale 1,2 sviluppo umano. Una seconda ragione è che aberrante regolazione genica tessuto specifica può avere conseguenze disastrose sullo sviluppo normale ed è noto per contribuire a una moltitudine di stati patologici tra cui il cancro. Pertanto, una migliore comprensione di una malattia che coinvolge le cellule ematopoietiche richiede la conoscenza delle cellule ematopoietiche sane.
Lo sviluppo di cellule ematopoietiche in procede midollo osseo attraverso un ordine sistematico di eventi caratterizzati da cambiamenti nell'espressione di marcatori di superficie cellulare 3. Gli studi che coinvolgono i partecipanti adulti hannodimostrato che il midollo osseo contiene di solito un basso numero di cellule B precursori 4,5; che coinvolgono studi pediatrici partecipanti hanno mostrato che la percentuale di precursore cellule B è relativamente alta in individui meno di 5 anni di età 6. Il sangue del cordone ombelicale viene utilizzato come fonte di cellule staminali ematopoietiche nel trattamento di malattie del sangue e tumori correlati, è disponibile attraverso banche del sangue del cordone e si arricchisce di B e cellule T immature 7, che sono le cellule bersaglio di disturbi multipli compresa leucemia e linfomi.
Precursore cellule B nel midollo osseo sono stati ampiamente fenotipizzati 8,9 e può essere definita dalla presenza di marcatori specifici della superficie cellulare che possono essere utilizzati per ordinare queste cellule in sottoinsiemi distinti. Normali cellule B differenziazione procede attraverso una serie di fasi nel midollo osseo a partire con le prime pro-B cellule e che si conclude con immaturi o ingenuo B-cellule. Secondoa van Zelm e colleghi 10, pro-cellule B sono caratterizzate dalla presenza di CD34 e nel passaggio alla fase 2 (Pre-BI) CD19 viene acquisita. Cellule Fase 3 (Pre-BII) non è più espresso CD34 e cominciare a esprimere IgM citoplasmatica. Infine, una caratteristica della fase 4 (immature cellule B) è l'espressione di IgM di superficie. La strategia di ordinamento descritto in questo protocollo è stato descritto da Caldwell e colleghi 6 e include l'uso di marcatori cellulari soli 3 superficie che riduce notevolmente la complessità e il costo di esecuzione di esperimenti selezione cellulare. Nel loro lavoro, una relazione tra CD45 e le fasi di B-differenziazione delle cellule è stato stabilito. Essi hanno osservato che cellule B nel midollo osseo visualizzare diversi livelli di espressione di CD45. Specificamente, le cellule che esprimono alti livelli di CD45 corrispondeva a cellule che esprimono IgM superficie immature (cellule B), quelli che esprime un livello intermedio di CD45 corrispondeva a cellule che esprimevano cytoplasmic IgM (pre-BII cellule), e quelli che esprimono livelli bassi di CD45 corrispondeva a cellule che non esprimono IgM citoplasmatica (pre-cellule BI). Questo protocollo utilizza la strategia sviluppata da Caldwell e colleghi 6 isolare sottoinsiemi di precursori delle cellule B di sangue del cordone ombelicale (Figura 1) che possono essere utilizzati in saggi a valle richiedono elevate qualità acidi nucleici come il CpG metilata-assay isola recupero (MIRA ) 11 e quantitative real time PCR. Il metodo impiega una separazione iniziale con biglie magnetiche ad esaurire tutti i non-B cellule da sangue del cordone ombelicale e richiede solo 3 colorazione con anticorpi (CD34, CD19 e CD45). Le cellule che sono state recuperate rappresentano 4 stadi di B-differenziazione delle cellule: 1) CD34 +, CD19 + (fine) pro-B e l'inizio del pre-BI, 2) CD34 -, CD19 +, CD45 bassa (fine pre-BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 med (pre-BII) e 4) CD34 -; CD19 +, CD45 alta (immature cellule B).
Il fattore con il maggiore impatto sul successo del protocollo è la presenza di contaminanti residui. Se la richiesta di sangue da una banca di sangue del cordone è importante avere il sangue spediti appena dopo la raccolta possibile. Inoltre, i campioni che sono classificati come linfocitosi più alto numero di linfociti, tuttavia, questi campioni non hanno un numero sufficiente di cellule B precursori e non deve essere utilizzato. Per aumentare la probabilità di ottenere un numero sufficiente di cellule per ciascuno dei sottoinsiemi precursori si consiglia iniziando con almeno 85 ml di sangue del cordone ombelicale.
È importante notare che, a differenza degli adulti separazioni sangue periferico, quando frazionamento cordone ombelicale lo strato mononucleare è spesso contaminata con globuli rossi 12. Questo protocollo include un ulteriore passaggio di lavaggio per rimuovere le piastrine contaminanti. Protocolli che descrivono separazioni mononucleate da sangue del cordone ombelicale suggeriscono di inserire una t fase di lisio rimuovere le indesiderate globuli rossi. Si sconsiglia di questo passo perché produce residui inquinanti e ha un impatto negativo sul successo del genere cella.
Al fine di ridurre il numero di cellule che devono essere distinti mediante citometria di flusso è necessario eseguire una B-cell arricchimento prima selezione cellulare. Il protocollo fornito da Miltenyi Biotec, che accompagna il B-Cell Isolation Kit (B-CLL), è stato ottimizzato per il sangue periferico e raccomanda l'utilizzo di 10 microlitri B-CLL cocktail di anticorpi biotina per 10 milioni di cellule. Questo passaggio utilizza anticorpi contro CD2 (cellule T, cellule NK), CD4 (cellule T), CD11b (granulociti, monociti, macrofagi), CD16 (cellule NK, macrofagi, mastociti), CD36 (piastrine), CD235a (cellule eritroidi) ad esaurire non-B cellule del sangue del cordone ombelicale. È importante utilizzare il kit descritto e non le cellule B Kit di isolamento II perché il kit primo contiene un anticorpo contro CD43, presente su cellule pro-B. Durante il nostro optimization di questo protocollo, abbiamo scoperto che un totale di 40 ml di B-CLL cocktail di anticorpi biotina è sufficiente a produrre un risultato positivo sorta cella. Inoltre abbiamo trovato che l'uso di non più di 5 pl più delle B-CLL cocktail di anticorpi biotina ha avuto effetti negativi per l'ordinamento delle cellule. Pertanto, si consiglia di utilizzare 40 ml di B-CLL cocktail di anticorpi biotina per un totale di numero di cellule mononucleate tra 175-250000000. Se si inizia con numeri inferiori o superiori di cellule può essere necessario per scalare i reagenti di conseguenza.
Ci sono numerose pubblicazioni contrastanti descrivono i marcatori che possono essere utilizzati per distinguere sottopopolazioni di cellule B. La maggior parte del discrepanza può essere spiegata dal fatto che la differenziazione è un processo continuo e che la presenza o l'assenza di marcatori di superficie cellulare avviene in modo graduale anziché in modo tutto o niente. In questo protocollo CD34 – / CD19 + e il livello di intensità di CD45 + (bassa, espressione media, alta) è stato utilizzato per distinguere pre-BI, pre-BII e immature cellule B con un aumento del livello di espressione di CD45 corrispondente alla progressione della differenziazione 6. Pro-cellule B sono stati descritti da alcuni come CD19 + / CD34 + 13 mentre altri hanno dimostrato che pro-B sono cellule CD19 – / CD34 + e pre-BI cellule CD19 + / CD34 + 9,10. Sulla base di queste discrepanze che hanno designato le CD19 + / CD34 + cellule più tardi pro-cellule B / primi pre-BI cellule. È importante notare che questa strategia è stata sviluppata per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B che corrispondono alle cellule colpite dalla malattia leucemia linfoblastica acuta. Tuttavia, ci sono molteplici strategie di ordinamento che possono essere impiegati a seconda del sottotipo cella di interesse.
Anticorpo-fluorocromi combinazioni dovrebbero essere scelti in base alle capacità del cell sorter disponibili. Come generil regola, la più brillante fluorocromo nel vostro gruppo dovrebbe essere usato per etichettare l'antigene meno popoloso e viceversa. Nel rilevamento doppio macchiato popolazioni, in particolare gli eventi rari come questi, la discriminazione doppietto (Figura 2B) è una parte di vitale importanza della strategia di gating. Questo assicura che i due eventi positivi sono veramente singole cellule colorate con anticorpi sia e non solo due singole cellule colorate aderenti l'uno all'altro.
Ad alta velocità, a 4 vie separazione delle cellule crea necessariamente un ambiente controllato aerosol. Pertanto, dal vivo l'ordinamento delle cellule umane deve essere eseguita con grande cura. Pubblicato le linee guida di sicurezza e di decontaminazione sono disponibili e devono essere verificate e attuate prima del genere 14. Approvazione da comitati istituzionali biosicurezza o loro equivalenti può essere richiesta prima di ordinamento. Per disinfettarli dopo la cernita, candeggina dovrebbe essere aggiunto al contenitore rifiuti ad una concentrazione finale del 10%. Similarly, tutti i tubi di campioni così come tutte le superfici nelle immediate vicinanze devono essere accuratamente decontaminate con una soluzione appena fatto candeggina al 10%.
In sintesi, questo protocollo prevede una strategia per ottenere popolazioni rare di precursori delle cellule B e può essere modificato per isolare qualsiasi popolazione rare presenti nel sangue del cordone incluse le cellule staminali ematopoietiche e cellule T immature. Recentemente, cellule B immature sono stati identificati nel sangue periferico di individui con HIV avanzata 15. Pertanto, l'utilità di questo metodo si estende oltre lo studio di tumori del sangue. Infine, non abbiamo ancora eseguito isolamenti RNA sulle celle di flusso ordinati, tuttavia, questo metodo dovrebbe essere adattabile con l'avvertenza che, nel corso di separazione delle cellule le cellule devono essere ordinati direttamente in Trizol o una soluzione equivalente RNA compatibili come RLT dal kit RNeasy disponibile attraverso Qiagen.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) a KT
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
Microscope | |||
accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |