Hücre içi Ca Ölçme<sup> 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm> Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu
Summary
Hücre içi Ca<sup> 2 +</sup> Dinamikleri Sperm fizyolojisi ve Ca çok önemlidir<sup> 2 +</sup> Duyarlı floresan boyalar onları incelemek için çok yönlü bir araç oluşturmaktadır. Nüfus deneyleri (fluorometri ve akış fluorometri durdu) ve tek bir hücre deneyleri (akım sitometri ve tek hücre görüntüleme) uzay-zamansal [Ca izlemek için kullanılır<sup> 2 +</supInsan sperm hücrelerinde>] değişir.
Abstract
Sperm, özellikle ulaşmak tanımak ve yumurta ile kaynaştırmak için tasarlanmış erkek üreme hücreleridir. Bu görevleri gerçekleştirmek için, sperm hücreleri sürekli değişen bir ortamda yüz ve birkaç fiziksel engelleri aşmak için hazır olmalıdır. Transkripsiyonel ve translationally sessiz özünde olan bu hareketli hücreler kendilerini yönlendirmek için çeşitli sinyal mekanizmaları derinden güveniyor ve yönlendirilmiş bir şekilde yüzmek ve yumurta bulmak için yolculuk sırasında çevre koşulları zorlu mücadele etmek. Özellikle, Ca 2 +-aracılı sinyal birkaç sperm fonksiyonları için çok önemlidir: motilite, kapasitasyonu (akrozom reaksiyonu için sperm hazırlayan karmaşık bir süreç) ve akrozom reaksiyonu (sperm-yumurta füzyon sağlayan bir eksositotik olay) aktivasyonu. Bu iyonun, hücre içi dalgalanmaları izlemek için flüoresan boyaların kullanım uygulaması duyarlılık kolaylığı nedeniyle önem arzetmektedir ve det yönlülükection. Tek boya yükleme protokolü kullanarak biz sperm Ca 2 + dinamikleri izlemek için dört farklı florometrik teknikleri kullanmaktadır. Her teknik hem tek bir hücre ve hücre popülasyonu düzeyde veri üreten, mekansal ve / veya zamansal çözünürlük sağlayan farklı bilgi sağlar.
Introduction
Ca 2 + ökaryotik hücrelerde sinyal iletim yollarının evrensel bir ikinci elçisidir. Hücre içi Ca 2 + (Ca 2 + i) heyecanlı ve olmayan heyecanlı hem hücrelerinde birçok temel fizyolojik süreçlerin düzenlenmesinde katılır. Ca 2 önemi ve evrenselliği + ikinci haberci olarak sinyal iletimi olaylar sırasında hücre içinde bilgi iletimi kendi uzay-zamansal çok yönlülük türetilmiştir. Ca 2 + de novo veya hücre, onun hücre içi konsantrasyonu ([Ca 2 +] i) içinde bozulmuş sentez edilemez farklı hücresel sürekli tampon, Sequester, bölümlere bu mekanizmaları ve / yoluyla çok sıkı sınırlar içinde tutulan veya Ca 2 birikir iken +. Bu iyon konsantrasyonu değişiklikler hücre 1 içinde son derece lokalize bölgelerde ortaya çıkar ve bu dalgalanmalar deşifre bir de kazanmak için gereklidir olabilirsinyal mekanizması (1) rolleri, (2), fizyolojik önemi, hücre sinyal iletimi ve (3) genel mekanizmaları eper anlaşılması. Ca2 +-aracılı sinyal sperm fizyolojisi 2'de özel bir önem taşımaktadır. Sperm hareketliliği döllenme başarı için en önemli işlevlerinden biridir ve aslında, birkaç sperm hareketliliğini kusurları kısırlığa 3-5 neden olabilir. + Flagellar hareket Ca 2 önemi uzun 6 kabul edilmiştir, ancak, Ca 2 + flagellar bükme, belirli bir formu nasıl kontrol mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır.
Yumurta eritme önce, sperm kapasitasyonu, kadın sistemi içinde sperm ikamet bağımlı karmaşık bir süreç geçmesi gerekir. Kapasitasyonu sırasında sperm membranın lipid mimarisi ve organizasyonu esas olarak plazma zarının kolesterol çıkarılmasının bir sonucu olarak, modifiye edilmiştir. Buna ek olarak, birçok protein tirozin-fosfor vardır7 ylated. Önemli olarak, kapasitasyonu sırasında hücre içi pH'ın artmasına (pH i) ve [Ca2 +] i, ve membran potansiyeli bazı türler 2 hiperpolarizasyona. Kapasitasyonu sadece sperm (% 20-40) bir alt grubunda yer alır ve tüm bu hücresel değişiklikler yer alan mekanizma tam olarak uzaktır. Genellikle fizyolojik bobin maruz kaldığında kapasitan sperm sadece bir alt akrozom reaksiyonu (AR) tabi olduğu kabul edilmektedir. AR da (dış ve iç zarları ile özel organel) bir akrozom sahip tüm türlerde döllenme için gerekli bir Ca 2 +-düzenlenmiş bir olaydır. Bu işlem sırasında spermin plazma zarı ile dış akrozomal membran sigortalar, sperm hücresi yumurta (zona pellucida veya ZP) çevreleyen gliko-protein matris nüfuz izin hidrolitik enzimler serbest. AR da etkileşim yeni füzyojenik sperm hücresi yüzey ortayaHer iki gamet son füzyon için yumurta plazma zarı. AR, progesteron en aralarında çalışılan biri olmak neden çeşitli hücresel ligandlar vardır.
Bu çalışmada biz ölçmek için bir Ca 2 + duyarlı floresan boya kullanımını içeren dört farklı tekniklerini [Ca 2 +] i progesteron tetiklediği insan sperm değişiklikler (biz [Ca 2 ölçülen hangi akım sitometri hariç + ] i) in vitro kapasitasyonu sürecinde sırasında neden artar. Bu özel durumda biz kullanılan Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), bir membran geçirgen bir boya Kd = 325 nM. In vitro metodolojiler biz üç ile zamanın bir fonksiyonu olarak izlenir floresan değişiklikler, ve dördüncü tekniği ile zaman içinde tek bir noktada floresan değerleri ölçülmüştür. Tamamen onlar mekansal ve zamansal res sağlarlar bu farklı yaklaşımlar, birbirini tamamlayıcıtek hücre ve hücre nüfus düzeyleri hem de olution.
Hücre Nüfus veya Toplu Deneyler
Onlar iyi kurulmuş, basit ve tek bir deneyde hücre milyonlarca üzerinde yapılan ölçümlerden bilgilerin ortalama için izin çünkü ihtiyaç duydukları araçları da hazır, ancak çünkü toplu teknikleri yaygın olarak sadece kullanılır.
Teknik 1.. Geleneksel Florometre
Bu teknik, bir zaman fonksiyonu olarak floresans değişiklikleri izler; deneyler 200 ile 1,000 arasında değişen ul numune hacmi ile cam küvet içinde gerçekleştirilir. Ilave reaktiflerin uygun karıştırma Manyetik bir karıştırma gerektirir ve bu nedenle elde edilen zamansal çözünürlüğü saniye seviyesindedir. Analiz edilen örnekler arasında tipik bir hücre konsantrasyon aralığı, 10 5 8 -10 hücre / ml 'dir.
Teknik 2.. Durduruldu Akış Florometre
Ttekniğini de zamanın bir fonksiyonu olarak floresans değişiklikleri izler, ancak reaktifler hızlı bir şekilde çok küçük bir numune hacmi (25-100 ul kadar) ihtiva eden bir kaydın küvet içinde (basınç kullanarak) birlikte karıştırılır. Bu nedenle, reaktif homojenizasyon milisaniye için yüksek temporal çözünürlük sağlayan, anlıktır. Ortaya çıkan floresan karşı zaman izleri analizi analiz örneklerin ortak bir hücre konsantrasyonu aralığı kısa süreli bir tepkime ara maddeler, vs hakkında bilgi elde edilmesi, reaksiyon mekanizması karmaşıklığı açıklık, tepkime hızını belirlemek için uygun olan 10 5 -10 7 hücre / ml.
Tek Hücre Deneyler
Toplu deneyler hücrelerin büyük bir sayısının ortalama davranışı rapor, ancak, bir popülasyon sıklıkla bu tip ölçümler sırasında göz ardı edilir heterojen özellikler sergileyebilirler. Tek hücre teknikleri böylece inci tamamlamak için kullanılıre bilgi hücre popülasyonu deneylerle elde.
Teknik 3.. Sitometrisi
Tek bir hücre ölçümlerinin kaynaklanan bilgiyi önemine rağmen, bütün bir nüfus hücreye spesifik özelliklerinin hatalı ekstrapolasyon önlemek amacıyla hücreleri, çok sayıda analiz etmek önemlidir. Bu nedenle, yüksek verimli teknikleri tercih edilmektedir ve en popüler yöntem durumda 10.000 hücreleri geleneksel olarak analiz edildiği, akım sitometri olduğunu. Onların boyutu (ileri dağılım (FSC)), boyu (yan dağılım (SSC)) ve floresan yoğunluğu (bir antikor ile özel etiketleme, canlılığı işaretleyici, vb) göre hücreleri sınıflandırır Bu yöntem heterojen nüfus çok-parametrik analiz sağlar , böylece bir hücre grubu için parametreleri 'dağıtım hakkında bilgi veren. Flow sitometri oldukça zaman bağımlı bilgi 8'den anlık sağlar. Ileri ve yan dağılım değerleri arhücreleri içerir, ancak floresan ölçümleri, negatif ve pozitif floresan kontroller için hücresel enkaz, toz, vb ayrımcılık bir kapı seçmek için de yararlıdır e de dahil edilmelidir. Birden fazla flüoresan kanalı kullanıldığında, dengeleme olarak bilinen bir işlem (ayrıntılar için bkz gerçekleştirilmelidir http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Tazminat fluorophores arasında spektral örtüşme ayrımcılık sağlar. Akış sitometri de propidyum iyodür boyaması yolu ile, genellikle, ölü hücreler arasında ayrım sağlar.
Teknik 4.. Tek Hücre Görüntüleme
Mikroskopi tek hücre davranışlarını incelemek için başka bir yaygın yöntem değil, iyi zamana bağlı çalışmaları için uygun ve aynı zamanda uzaysal çözünürlüğü sağlar. Bir büyük dezavantajı yüksek verimlilik analizi şu anda emekleme döneminde sadece olmasıdır <s9> kadar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre içi sinyal en hücresel faaliyetleri için hayati önem taşımaktadır, Ca 2 + yaşam döngüsünün sonuna kadar, gübreleme kendi kökenli, onların bütün ömrü boyunca memeli hücrelerinde eşlik her yerde bulunan bir elçisidir. Farklı uyaranlara yanıt olarak, [Ca 2 +] i artar, salınır ve uzay-zamansal kodlama ile azalır, buna göre, çeşitli süreçler aktive, modüle veya Ca 2 +-kodlanmış mesajları ile sonlandırıldı. Hücre içi Ca2 + iyon Bu siny…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım için Jose Luis De la Vega, Erika Melchy ve Dr Takuya Nishigaki teşekkür ederim. Dirección General de asuntos del Kişisel Académico / Universidad Nacional Autonoma de México (CT IN202212-3); Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Meksika) (BT için 99.333 ve 128.566) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5×5 ml |
References
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa. Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).
- Esposito, G., et al. Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).
- Carlson, A. E., et al. Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation. PLoS ONE. 4, e6844 (2009).
- Brokaw, C. J. Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids. J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, 1139-1150 (1995).
- Svahn, H. A., van den Berg, A. Single cells or large populations. Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).
- Strunker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P., et al. The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels. Annu. Rev. Physiol. , (2011).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).
- Kilic, F., et al. Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone. Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Xia, J., Ren, D. The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).
- Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation. Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).
- Baldi, E., et al. Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa. J. Androl. 12, 323-330 (1991).
