Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos
Summary
Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.
Abstract
La interacción de las plaquetas activadas y leucocitos (principalmente neutrófilos) en el endotelio activado trombosis media y la inflamación vascular. 1,2 Durante la formación de un trombo en el sitio de la lesión arteriolar, las plaquetas adherentes al endotelio activado y proteínas subendoteliales matriz de soporte de rodadura de neutrófilos y la adherencia. 3 A la inversa, bajo venulares condiciones inflamatorias, neutrófilos adherentes al endotelio activado puede soportar la adhesión y acumulación de plaquetas circulantes. Heterotípicos plaquetas agregación de neutrófilos requiere procesos secuenciales por las interacciones con los receptores específicos de receptor-contador entre las células. 4 Se sabe que las células endoteliales activadas liberan moléculas de adhesión tales como el factor de von Willebrand, iniciando así la adhesión de las plaquetas y la acumulación bajo condiciones de alto cizallamiento. 5 Además, células endoteliales activadas soporte rodante de neutrófilos y la adhesión por selectinas que expresan unmolécula-1 d adhesión intercelular (ICAM-1), respectivamente, en condiciones de bajo cizallamiento. 4 de plaquetas P-selectina interactúa con los neutrófilos a través de P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induciendo de ese modo la activación de neutrófilos β2 integrinas y firmes adhesión entre dos tipos de células. A pesar de los avances en los experimentos in vitro en el que heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones se determinan en sangre entera o de células aisladas, 6,7 esos estudios no se pueden manipular las condiciones de estrés oxidativo durante la enfermedad vascular. En este informe, utilizando marcadas con fluorescencia, anticuerpos específicos contra un ratón de plaquetas y neutrófilos marcador, se describe un protocolo detallado intravital microscópico para monitorear las interacciones heterotípicas de plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante TNF-α inducida por inflamación o por láser inducida lesión del músculo cremáster en microvasos de ratones vivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo detallado para tiempo real microscopía de fluorescencia intravital para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y trombosis. Anteriormente, los enfoques similares microscópicas de fluorescencia se registraron para estudiar el mecanismo molecular de la formación de trombo y la inflamación vascular. 8,12 Desde el heterotípicos interacción célula-célula podría ser importante para la oclusión …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (P30 HL101302 y RO1 HL109439 a JC) y la American Heart Association (SDG 5270005 a JC). A. Barazia fue apoyado por una beca de formación T32HL007829 NIH.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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