نماذج الماوس لتصلب الشرايين الكسب غير المشروع
Summary
نحن تصف بروتوكولات لدينا arteriosclerois الكسب غير المشروع الماوس (GA) نماذج التي تنطوي على مداخلة من شريحة سفينة الماوس إلى المتلقي من نفس السلالة الفطرية. بواسطة backcrossing بتغيرات جينية إضافية إلى الجهة المانحة السفينة، يمكن للنموذج تقييم تأثير جينات معينة على GA.
Abstract
arteriosclerois الكسب غير المشروع (GA)، وتسمى أيضا اعتلال وعائي طعم خيفي، هي آفة مرضية أن يتطور مع مرور أشهر إلى سنوات في الأعضاء المزروعة التي تتميز منتشر، تضيق كفافي من شجرة الأوعية الدموية الكسب غير المشروع بأكمله. العنصر الأكثر أهمية من GA المرضية هو انتشار السلس خلايا تشبه العضلات داخل البطانية. عندما يتم موسط شريحة الشريان التاجي الإنسان في أبهر الأشعة تحت الكلوي من الفئران العوز المناعي، وintimas يمكن توسيع ردا على خلايا T الإنسان نقل adoptively خيفي إلى الجهة المانحة الشريان أو خارجية الإنسان الإنترفيرون γ في غياب الخلايا التائية البشرية. مداخلة من الشريان الأورطي الفار من سلالة واحدة إلى أخرى المستلم سلالة الماوس يقتصر كنموذج لهذا الرفض المزمن في البشر لأن استجابة الرفض الخلية بوساطة الحادة في هذا النموذج الماوس يلغي تماما كل الخلايا المانحة المستمدة من الأوعية الدموية من الكسب غير المشروع في غضون شهرين الى ثلاثة أسابيع. وقد وضعنا مؤخرا اثنين متر جديدة[أوس] نماذج للتحايل على هذه المشاكل. النموذج الأول ينطوي على مداخلة من شريحة سفينة من ماوس الذكور إلى مستلم الإناث من نفس السلالة الفطرية (C57BL/6J). يتم توجيه رفض الكسب غير المشروع في هذه الحالة فقط ضد مستضدات التوافق النسيجي طفيفة المشفرة بواسطة كروموسوم Y (موجودة في الذكور ولكن ليس الأنثى) واستجابة الرفض الذي تستتبعه هو كسلان بما فيه الكفاية للحفاظ على خلايا العضلات الملساء المانحة المستمدة لعدة أسابيع. النموذج الثاني ينطوي فاصلة شريحة الشريان من النوع البري C57BL/6J المانحة الماوس إلى ماوس المضيف من نفس السلالة والجنس التي تفتقر إلى مستقبلات للالإنترفيرون γ تليها إدارة الماوس الإنترفيرون γ (تسليمها عن طريق العدوى من الفأرة الكبد مع متجه الفيروسة الغدانية، وليس هناك رفض في هذه الحالة لأن كلا من الجهات المانحة والمتلقية الفئران هي من نفس السلالة والجنس ولكن الخلايا المانحة العضلات الملساء تتكاثر ردا على خلوى في حين أن الخلايا المشتقة من المضيف، وتفتقر إلى مستقبلات للهذا خلوى، لا تستجيب. بواسطة backcrossing بتغيرات جينية إضافية إلى الجهة المانحة السفينة، كلا النموذجين يمكن استخدامها لتقييم تأثير جينات معينة على GA التقدم. هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة لدينا الماوس GA النماذج.
Introduction
arteriosclerois الكسب غير المشروع (GA)، وتسمى أيضا اعتلال وعائي طعم خيفي، هي آفة مرضية أن يتطور مع مرور أشهر إلى سنوات في الأعضاء المزروعة التي تتميز منتشر، تضيق كفافي من كامل شجرة الأوعية الدموية الكسب غير المشروع 7. قد يسبب المراحل المبكرة التضيق غريب الأطوار والتنسيق التي هي أكثر وضوحا في الشرايين، وبالتالي تشبه على نحو أوثق التضيق ينظر في تصلب الشرايين التقليدية. فقدان التجويف السفن الكسب غير المشروع نتائج من التوسع باطنة بسبب تسلل الخلايا T المضيفة والضامة وخصوصا لتراكم المصفوفة خارج الخلية والعضلات الملساء مثل الخلايا نشأت من الكسب غير المشروع، مضيف أو كليهما 5، 13، 19، أن يتم تعويض كاف بواسطة الخارج إعادة عرض السفينة. في المغايرة القلب، الآفات الأكثر أهمية هي تلك سريريا في الشرايين التاجية نخابي وداخل عضلة القلب. في نهاية المطاف، سوف GA الشرايين التاجية يسبب فشل القلب الإقفاري. GA هو السبب الرئيسي في وقت متأخر غرام القلبفقدان الخلف. والتضيق من GA تتوقف عند خطوط الدرز، تورط بقوة استجابة المضيف لalloantigens الكسب غير المشروع في المرضية ويقودنا لتصنيف GA باعتبارها شكلا من أشكال الرفض المزمن 3. ومع ذلك، قد غيرها من إصابة الشرايين أشكال تزيد من خطر GA، إما من خلال زيادة العبء صافي الإصابة أو عن طريق تكثيف و / أو تحوير استجابة منيع للمستضد الخيفي. يتم الاحتفاظ الخلية (EC) بطانة بطانة الشرايين الكسب غير المشروع في GA الإنسان والمناطق الأكثر سطحية من البطانية المتاخمة للبطانة EC هو موقع تسلل بشدة من المضيف المستمدة من الإنترفيرون γ إنتاج خلايا تي والضامة 11؛ في بعض المرضى يرتبط GA مع تطور alloantibodies المانحة الخاصة التي تربط لالكسب غير المشروع EC 16 ولكن الأوعية تظهر أدلة تذكر للنخر فيبرينية الذي هو سمة من الرفض الحاد الأجسام المضادة التي تتوسط فيها 11.
العنصر الأكثر أهمية من GA المرضية هوانتشار الخلايا على نحو سلس مثل العضلات داخل البطانية، وإذا كان يمكن القبض على هذه العملية، من غير المرجح أن تقدم GA. وكان العمل السابق من مجموعتنا أظهرت أن intimas من قطاعات الشريان التاجي الإنسان موسط في أبهر الأشعة تحت الكلوي من الفئران العوز المناعي توسيع استجابة لخلايا نقل adoptively T الإنسان خيفي إلى الجهة المانحة الشريان وأن هذه العملية يمكن أن تحول دون تحييد الإنسان الإنترفيرون γ 18. الخارجية علاوة على ذلك الإنسان الإنترفيرون γ يمكن أن تسبب باطنة (وسطي) انتشار الخلايا العضلية الملساء (VSMC) الأوعية الدموية في هذه الطعوم الشريانية في غياب الخلايا التائية البشرية 15 و 17. (من المهم أن نلاحظ أن الإنسان والفأر الإنترفيرون γ لا يعبرون الأنواع، مستبعدا الآثار غير المباشرة على المضيف الماوس في هذا النظام التجريبي.) هذه نماذج الماوس أنسنة والاستفادة من تلخص الإنسان T خلية / التفاعلات الخلية الأوعية الدموية وباطنة وتتكون إلى حد كبير من الآفات الخلايا البشرية (أي الكسب غير المشروع المستمدة)،كما لوحظ في العينات السريرية، لكنها لا تلخص تماما الوضع السريري لأنها تتجاهل دور الضامة المضيف وأنواع الخلايا ربما الأخرى المشاركة في الآفات زرع السريرية. A نموذج الفأر التقليدية من هذه العملية يمكن أن تعالج هذه المشكلة نظريا، استكمال أوجه القصور في نموذج إنساني من خلال إشراك الجهاز المناعي المضيف كاملة وتوفير ميزة إضافية تتمثل في السماح للقوة النهج الوراثية الماوس ليتم تطبيقها على جورجيا. نماذج الماوس الأكثر استخداما على نطاق واسع اثنين تنطوي على زرع القلب والشريان منتبذ مثلي زرع 1. مصنوعة من الآفات التي تنمي في شرايين القلب ترقيع منتبذ إلى حد كبير من خلايا المضيف، على الأرجح من أصل نخاع العظام، في حين أن الخلايا البطانية في الشرايين في ترقيع قلب الإنسان هي في الغالب من أصل الكسب غير المشروع 5، 13، 19. هذا هو الفرق الكبير الذي أدى بنا إلى تطوير نماذج الماوس بديل. مداخلةوالشريان الأورطي الفار من سلالة واحدة إلى أخرى المستلم سلالة الفأر هو محدود حتى أكثر كنموذج لهذا الرفض المزمن في البشر لأن الخلية بوساطة الحاد استجابة الرفض في هذا النموذج الماوس يلغي تماما كل خلايا الأوعية الدموية المانحة المستمدة من الكسب غير المشروع في غضون شهرين الى ثلاثة 19 أسابيع. وبالتالي، فإن تغييرات لاحقة شهدت في قطاع سفينة موسط هي وحدها استجابة الخلايا المضيفة التي إسكانها في decellularized سفينة السقالة، وخلق حالة مصطنعة للغاية من أهمية محدودة كنموذج للتغيرات في الأوعية الكسب غير المشروع التي تحدث في العيادة. وقد وضعنا مؤخرا اثنين من نماذج الماوس الجديد للتحايل على هذه المشاكل 21. النموذج الأول ينطوي على مداخلة من شريحة سفينة من ماوس الذكور إلى مستلم الإناث من نفس السلالة الفطرية (C57BL/6J). النموذج الثاني ينطوي فاصلة شريحة الشريان من النوع البري C57BL/6J المانحة الماوس إلى ماوس المضيف من نفس السلالة والجنس التي تفتقر إلى تفصيلeptor لالإنترفيرون γ (الإنترفيرون γR-KO)، يليه إدارة الماوس الإنترفيرون γ (تسليمها عن طريق العدوى من كبد الفأر مع متجه الفيروسة الغدانية. هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة ومزايا لدينا الماوس GA النماذج.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتركز البروتوكولات المذكورة على نماذج GA الماوس. يمكن تطبيق إجراءات لنماذج أخرى زرع الكسب غير المشروع. وتشمل هذه النماذج طعم أجنبي أنسنة (أي قطاعات الشريان التاجي الإنسان موسط في أبهر الأشعة تحت الكلوي من الفئران العوز المناعي)، ورفض نموذج الفأر GA الحادة (أي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL109420 إلى WM وAHA 9320033N إلى LY.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks) |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml) |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml) |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml) |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml) |
| Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride) | CareFusion | AL4109 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | To prepare the anesthetic |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Microscope | Leica | MZ95 | |
| Micro Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5693 | |
| Spring Scissors | F.S.T | 15009-08 | To transect the aorta of donor or recipient |
| Extra Narrow Scissors | F.S.T | 14088-10 | |
| Needle Holder/Forceps | MICRINS | MI1542 | To hold the needle |
| Fine Forceps | F.S.T | 11254-20 | |
| Forceps | F.S.T | 11251-35 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Forceps | F.S.T | 13011-12 | |
| LANCASTER Eye Speculum | Zepf Medical Instruments | 42-1209-07 | |
| Micro Vascular Clip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6472 | |
| Micro Clip Applying Forceps With Lock | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5440 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture | AROSurgical Instruments Corporation | Cat #T4A10Q07 | 10-0 suture, Needle=70 microns |
| Black Monofilament Nylon Suture | Syneture (Covidien) |
SN-1956 | 6-0 suture |
| Non-Woven Songes | McKesson Corp. | Reorder No. 94442000 | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | REF 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 18G 1 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305196 | |
| 25G 7/8, Hypodermic Needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305109 | |
| 30G 1/2, Hypodermic Needle | BD | REF 305106 | |
| Hearting Pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
References
- George, J. F., Pinderski, L. J., Litovsky, S., Kirklin, J. K. Of mice and men: mouse models and the molecular mechanisms of post-transplant coronary artery disease. J. Heart Lung Transplant. 24, 2003-2014 (2005).
- Koulack, J., McAlister, V. C., MacAulay, M. A., Bitter-Suermann, H., MacDonald, A. S., Lee, T. D. Importance of minor histocompatibility antigens in the development of allograft arteriosclerosis. Clin. Immunol. Immunopathol. 80, 273-277 (1996).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Lorber, M. I., Wilson, J. H., Robert, M. E., Schechner, J. S., Kirkiles, N., Qian, H. Y., Askenase, P. W., Tellides, G., Pober, J. S. Human allogeneic vascular rejection after arterial transplantation and peripheral lymphoid reconstitution in severe combined immunodeficient mice. Transplantation. 67, 897-903 (1999).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Mitchell, R. N. Allograft arteriopathy: pathogenesis update. Cardiovasc. Pathol. 13, 33-40 (2004).
- Mitchell, R. N. Graft vascular disease: immune response meets the vessel wall. Annu Rev Pathol. 4, 19-47 (2009).
- Nagano, H., Libby, P., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Stinn, J. L., Becker, G., Tilney, N. L., Mitchell, R. N. Coronary arteriosclerosis after T-cell-mediated injury in transplanted mouse hearts: role of interferon-gamma. Am. J. Pathol. 152, 1187-1197 (1998).
- Nagano, H., Mitchell, R. N., Taylor, M. K., Hasegawa, S., Tilney, N. L., Libby, P. Interferon-gamma deficiency prevents coronary arteriosclerosis but not myocardial rejection in transplanted mouse hearts. J. Clin. Invest. 100, 550-557 (1997).
- Raisanen-Sokolowski, A., Glysing-Jensen, T., Koglin, J., Russell, M. E. Reduced transplant arteriosclerosis in murine cardiac allografts placed in interferon-gamma knockout recipients. Am. J. Pathol. 152, 359-365 (1998).
- Salomon, R. N., Hughes, C. C. W., Schoen, F. J., Payne, D. D., Pober, J. S., Libby, P. Human Coronary Transplantation-Associated Arteriosclerosis – Evidence for a Chronic Immune Reaction to Activated Graft Endothelial Cells. Am. J. Pathol. 138, 791-798 (1991).
- Scott, D. M., Ehrmann, I. E., Ellis, P. S., Chandler, P. R., Simpson, E. Why do some females reject males? The molecular basis for male-specific graft rejection. J. Mol. Med. 75, 103-114 (1997).
- Shimizu, K., Sugiyama, S., Aikawa, M., Fukumoto, Y., Rabkin, E., Libby, P., Mitchell, R. N. Host bone-marrow cells are a source of donor intimal smooth- muscle-like cells in murine aortic transplant arteriopathy. Nat. Med. 7, 738-741 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circ. Res. 100, 622-632 (2007).
- Tellides, G., Tereb, D. A., Kirkiles-Smith, N. C., Kim, R. W., Wilson, J. H., Schechner, J. S., Lorber, M. I., Pober, J. S. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Vassalli, G., Gallino, A., Weis, M., von Scheidt, W., Kappenberger, L., von Segesser, L. K., Goy, J. J. Alloimmunity and nonimmunologic risk factors in cardiac allograft vasculopathy. Eur. Heart J. 24, 1180-1188 (2003).
- Wang, Y., Bai, Y., Qin, L., Zhang, P., Yi, T., Teesdale, S. A., Zhao, L., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ. Res. 101, 560-569 (2007).
- Wang, Y., Burns, W. R., Tang, P. C., Yi, T., Schechner, J. S., Zerwes, H. G., Sessa, W. C., Lorber, M. I., Pober, J. S., Tellides, G. Interferon-gamma plays a nonredundant role in mediating T cell-dependent outward vascular remodeling of allogeneic human coronary arteries. Faseb J. 18, 606-608 (2004).
- Yacoub-Youssef, H., Marcheix, B., Calise, D., Thiers, J. C., Benoist, H., Blaes, N., Segui, B., Dambrin, C., Thomsen, M. Chronic vascular rejection: histologic comparison between two murine experimental models. Transplant. Proc. 37, 2886-2887 (2005).
- Yokota, T., Shimokado, K., Kosaka, C., Sasaguri, T., Masuda, J., Ogata, J. Mitogenic activity of interferon gamma on growth-arrested human vascular smooth muscle cells. Arterioscler. Thromb. 12, 1393-1401 (1992).
- Yu, L., Qin, L., Zhang, H., He, Y., Chen, H., Pober, J., Tellides, G., Min, W. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting IFN-γ-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Cir. Res. 109, 418-427 (2011).
