Yama-kelepçe elektrofizyoloji ile kombine edildiğinde tanımlanan kompozisyon dev lipozomlar içine fonksiyonel membran proteinleri yeniden kurgulamak güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, geleneksel dev lipozom üretim protein istikrar ile uyumsuz olabilir. Biz saf lipidler veya iyon kanalları içeren küçük lipozomlar gelen dev lipozomlar üretmek için protokolleri tarif.
Elektrofizyolojik kayıt için kimyasal yapısı lipid membranlar içine iyon kanallarının sulandırma bu önemli proteinlerin işlevini tanımlamak ve keşfetmek için güçlü bir teknik olmuştur. Ancak, düzlemsel bilayers gibi klasik preparatlar, sulandırılmış kanal ve membran ortamında yapılabilir manipülasyonlar ve deneyler sınırlar. Dev lipozomlar daha fazla hücre-benzeri bir yapı lipid ortam kontrolü ödün vermeden geleneksel patch-clamp deneyleri izin verir.
Electroformation bir elektrot yüzeyinde biriken ince, sipariş edilen lipit filme gerilim alternatif uygulama dayanır çapı dev lipozomlar> 10 um üretmek için etkili bir ortalamasıdır. Klasik protokol organik çözücüler yatırılır lipidler çağrısında beri Ancak, iyon kanalları gibi daha az güçlü membran proteinleri ile uyumlu değildir ve değiştirilmesi gerekir. Son zamanlarda, protocols bizim laboratuarda protein içeren lipozomlara adapte kısmen kurutulmuş küçük lipozomlar arasından dev lipozomlar Electroform için geliştirilmiştir.
Burada arka plan, ekipman, teknikleri, ve küçük lipozom dağılımları gelen dev lipozomlar electroformation tuzaklar mevcut. Biz takip daha zorlu protokolleri başlamadan önce ilk hakim olmalıdır klasik protokol ile başlar. Biz doymuş tuz çözeltileri ile buhar denge kullanarak küçük lipozomlar kontrollü kısmi dehidrasyon süreci göstermektedir. Son olarak, electroformation kendisinin işlemi göstermektedir. Biz yüksek kaliteli lipozomlar üretmek ve en iyi sonuçları elde etmek için her aşamada hazırlık görsel denetim tanımlamak için in-house yapılabilir basit ve ucuz ekipman anlatacağız.
Dev lipozomlar (genellikle dev unilamellar veziküller veya GUVs denir) öncelikle çift katlı deformasyon, yanal faz bir arada ("sal"), membran füzyon, vb 1-4 çalışmaları da dahil olmak üzere çift katlı lipit katmanını fiziği ve fiziksel kimya, incelemek için kullanılmıştır. Kolayca çevredeki sulu tampon farklı yapılabilir, sulu bir iç çevreleyen zarın küresel kabuk: Bir ağır hücre-benzeri bir yapıya sahiptir. Onlar, tanımı gereği, çapı ≈ 1-100 mikron, böylece ışık mikroskobu çeşitli yaklaşımlar kullanılarak görüntülenebilir vardır. Bunlar genellikle yumuşak iken, bunların özellikleri kolay kullanım için manipüle edilebilir, böylece ozmotik eğimleri veya mekanik olarak uygulanan gerilim ile gergin yapılabilir. Özellikle, lipozomun bir "sertlik" elektrofizyoloji "lipozom-bağlı" ya da eksize yamalar oluşturmak için o basit kontrol etmektedir. Geçmişte, iyon kanalı sulandırma büyük ölçüde düzlemsel bir lipit b gerçekleştirildiilayers. Şimdi, dev lipozomlar gelen yamalar oluşturmak ve geleneksel elektrofizyoloji için geliştirilen araçların önemli titreme (floresan mikroskobu, mikropipet aspirasyon, hızlı perfüzyon ve sıcaklık kontrolü, vb) kullanma yeteneği sulandırma çalışmaları 5,6 için dev lipozomlar giderek daha cazip hale getirmektedir.
Dev lipozomlar birçok strateji tarafından yapılmıştır. Kurutulmuş bir lipid filmi 4,7,8 sulandırılır Aslında, dev lipozomlar bir şişme işlemi ile kendiliğinden oluşturur. Daha hızlı daha büyük hazırlamak arzusu, daha düzgün lipozomlar electroformation 1,9 aralarında baş diğer yaklaşımlar, araştırmacılar yol açtı. Electroformation de kurutulmuş bir lipid filmi hidrasyonu dayanır, ancak lipid filmi arasında salınımlı bir elektrik alanının uygulanması yoluyla işlemini hızlandırır. Alan veya su ile ayrılmış, iki elektrot, platin teller ya veya İndiyum-Kalay-Oksit (ITO) kaplı cam slaytlar ile uygulanırtampon ve hangi üzerine lipidler yatırılır. Lipozomlar şişme hızlandırarak, daha büyük bir lipozomlann daha yüksek bir verim elde eder. Böylece, electroformation dev lipozomlar 4 üretmek için varsayılan yöntem haline gelmiştir.
Electroformation mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır ve protokollerin çoğu (örneğin 10,11) deneysel olarak geliştirilmiştir. Yine de, teori ve bazı ampirik sonuçları dikkate alınarak beklemek ne hakkında biraz bilgi edinebilirsiniz. Bu yaygın electroformation biriken lipid filmi 10,11 yığılmış bağımsız lipid iki tabakanın arasında bulunan bir tampon arasında elektro-ozmotik akış sürerek olduğuna inanılır. Çift katlı lipit katmanını termal dalgalanmalara Elektrostatik bağlantısı da muhtemelen 12 ilgilenmektedir. Bu hipotez niteliksel 10,12 kullanılabilir elektrik alan frekans ve güç için üst sınır tahmin. Özellikle de, bu yüksek iletkenliği olan çözümler tahmin edilmektedir ( <em> yani fizyolojik tuz çözeltileri) lipozom electroformation 12 başlatabilir elektrohidrodinamik kuvvetleri azaltır. Elektro-akış oranları genellikle artan tuz konsantrasyonu ile azalır ve sık sık bir elektrik alanı salınım frekansı (örneğin, farklı bir geometriye, Green ve ark. 13 de olsa) zirve edilir. Böylece, daha yüksek alan güçlü ve yüksek frekanslarda sınırları 10 içinde, yüksek iletkenlik çözüm için makul.
Bununla birlikte, membran proteinleri daha sonra, ince bir lipid filmi terk etmek için buharlaştırılarak organik çözücü içinde, yani, electroswelling işlem için elektrotlar üzerine lipid yatırma olağan yöntem ile uyumlu olması muhtemeldir. Bu zorluk etrafında iki temel yol vardır: dev lipozom oluşumundan sonra proteinler dahil etmek, ya da lipid yatırılır nasıl adapte. Yaklaşımımız lipid ve reconsti yatırmak diğerleri 5,11 üzerine inşaküçük veya büyük "proteoliposomes" bir süspansiyon araya membran proteini TÜTED. Biz (Collins ve Gordon, yorumda) başka bir yerde protein ve lipid saflaştırılmış proteoliposomes üretme uzun ve daha zorlu süreci tanımlamak. Burada, herhangi bir proteinin yokluğunda protokol açıklar, ancak protein dahil edildiğinde bu aynıdır, biz iyon kanalı TRPV1 içeren proteoliposomes GUVs dönüştürülmüş ve patch-clamp elektrofizyoloji için kullanılabilir olduğunu gösteren sonuçlar bulunmaktadır. Her electroformation yaklaşımda, lipit birikmesini işlemi sırasında lipid örnek görsel inceleme başarısı için çok önemlidir.
Yaklaşımımız iyon kanalı sulandırma için özel bir uygulama ilerisi için uygun olabilir. Öncelikle bu protokolü geliştirildi ve şimdi, aynı zamanda lipid electroformation için elektrotlar üzerinde biriken edildiği şekilde ortaya çıkan GUVs en kompozisyon heterojen nasıl etkilediğini gösterilmiştir beri süre içinde. BaykAl-Çağlar ve ark. 14 dikkatle kurutulmuş lipozom oluşan GUVs çeşitli fosfolipidleri ve kolesterol karışımlarından oluşan GUVs karışabilirliklerine geçiş sıcaklığında bir 2.5 kat daha küçük bir varyasyonu olmadığını gösterdi. Bunların çalışma lipid kanşımından lipidler, özellikle de kolesterol, Mayıs çökelti biriken lipid filmi bileşiminde büyük mekansal değişimi ile sonuçlanan, organik çözücü tevdi var olduğunu gösterir. Bu lipit membran faz davranışları çalışmaları için önemlidir, aynı zamanda iyon kanalı fonksiyonu kantitatif deneyler için kritik olabilir. Baykal-Çağlar ve ark. 'In protokol benzer ama kendi ile aynı değildir, ve okuyucular gibi iyi çalışmak için teşvik edilmektedir.
Bu protokol, (genel bakış, Şekil 1 'e bakınız) kullanılabilir birçok biridir. Prensip electroformation başarı olarak lipit karışımı, hidrasyon, sıcaklık, diğer solütler (özellikle iyonlar), ve bağlıdıroluşumunda kullanılan ders voltaj ve frekans. Electroformation daha iyi anlaşılır hale geldikçe, daha bizim protokol rafine bekliyoruz.
Son olarak, dev lipozomlar elektro dik bir öğrenme eğrisi çoğu zaman. Biz lipozomal süspansiyonlar (Bölüm 2-5) den lipidler yatırmak öğrenme önce mastering geleneksel protokolü (Bölüm 1 ve 4, ve, gerekirse, Bölüm 5) öneririz.
Dev lipozomlar Electroformation çeşitli lipitler, preparatları ve tamponlar ile uyumlu esnek bir yöntem haline gelmiştir. Lipit birikmesini sürecin dikkatle kontrol başarısı için çok önemlidir. Biz küçük lipozom preparatları basit bir süreçten lipidlerin kontrollü birikimi yapmak için basit araçlar sunduk. Nispi nem ilk lipozomlar uygun dehidrasyon için kritik olan, ve en iyi değeri lipozom süspansiyonu, katıların başlangıç konsantrasyonuna bağlı olarak değişecektir. Düşük bağ?…
The authors have nothing to disclose.
Biz electroformation cihazı oluşturmak için Bryan Venema ve Eric Martinson teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Tıp Ulusal Bilimler Enstitüleri hibe (SEG için R01GM100718) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü (SEG için R01EY017564) tarafından finanse edildi.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |