Summary

Die<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

Published: February 19, 2013
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Summary

Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um ein robustes Modell von Infektionskrankheiten und Colitis zu produzieren, sowie die Methoden zur Citrobacter rodentium Infektion in Mäusen zu charakterisieren. C. rodentium ist ein gram-negative, murine bestimmte bakterielle Erreger, die eng mit der klinisch wichtige menschliche Krankheitserreger enteropathogenen E. verwandt ist coli und enterohämorrhagischen E. coli. Nach Infektion mit C. rodentium, immunkompetenten Mäusen leiden bescheiden und vorübergehende Gewichtsverlust und Durchfall. Histologisch sind Darm-crypt Dehnung, Immun-Zell-Infiltration und Becherzellen Zell-Depletion beobachtet. Clearance der Infektion wird nach 3 bis 4 Wochen erreicht. Messung der intestinalen Epithelbarriere Integrität, bakterielle Belastung und histologische Schäden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion, erlauben die Charakterisierung von Mausstämmen anfällig für Infektionen.

Die Virulenz Mechanismuss mit dem bakteriellen Erreger besiedeln den Darm ihrer Wirte sowie bestimmten Host Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen sind weitgehend unverstanden. Deshalb ist die C. rodentium Modell enterischen bakterielle Infektion dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Es wurde vermutet, dass die maladaptive chronischen Entzündungsreaktionen bei CED-Patienten gesehen, bei genetisch anfälligen Personen nach abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Darmbakterien zu entwickeln. Daher bietet die Studie von Modellen von infektiöse Kolitis erhebliches Potential zur Definition potentiell pathogenen Host Reaktionen auf Enterobakterien. C. rodentium induzierte Colitis ist eine solche seltenen Modell, das für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien ermöglicht,, das Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese;essentiell für die Entwicklung von neuartigen präventiven und therapeutischen Behandlungen.

Introduction

Infektion durch enterale bakterielle Erreger löst gastrointestinale (GI) Entzündungen sowie Darm-Pathologie und Pathophysiologie, einschließlich Durchfall und Darm-epitheliale Barriere Dysfunktion. Die Virulenz Mechanismen, durch die bakteriellen Erreger besiedeln den GI-Trakt der Gastgeber, sowie spezielle Host-Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen schlecht verstanden werden, haben jedoch Fortschritte in der Modellierung von enterischen bakterielle Infektionen begonnen, unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Die IBDs Morbus Crohn (CD) und UC sind komplexe Erkrankungen unbekannter Ätiologie, die durch chronische Darm-Entzündung und Gewebeschädigung gekennzeichnet. Viele Mausmodellen Darmentzündung existieren, durch spontane Entzündung in genetisch modifizierten Stämme wie IL10 – / – Mäuse, um chemische Herausforderungen mit Verbindungen, wie Dextran Natriumsulfat (DSS) und dinitrobenzene sulfonsäure (DNBS) 1. Es wurde vermutet, dass die Fehlanpassung chronischen Entzündungsreaktionen in IBD-Patienten bei genetisch vorbelasteten Individuen entwickeln bei einem abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Enterobakterien 2, also in der Studie von Modellen von infektiöse Kolitis auch signifikante Möglichkeit der Festlegung von potentiell pathogenen Host . Reaktionen auf Enterobakterien Citrobacter rodentium induzierte Colitis ist eines der seltenen Modelle infektiöse Kolitis, aber gut 1,3 dadurch, so dass für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien und weiteres Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese; ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung neuartiger präventiven und therapeutischen Behandlungen.

C. rodentium ist ein Anbringen und gramnegative Effacing (A / E), Murines spezifischen bakterielles Pathogen, das eng mit dem wichtigen menschlichen zusammenhängtPathogene enteropathogenen E. coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) 3-8. Die Familie von A / E Pathogene innig an die apikale Wirtszellmembran der Blinddarm und Kolonepithel befestigen, Bilden einer nicht-invasiven sockelartigen Struktur auf der Wirtszelle. Oral Herausforderung mit C. rodentium von 10 8 -10 9 Organismen produziert eine robuste Ausführung der infektiöse Kolitis durch die mikrobielle Hyperplasie oder Dehnung der Krypten, einkernigen Immunzelle Infiltration und Becherzellen Zelldepletion 3,4 charakterisiert. Der Ort der ersten Besiedlung, ein paar Stunden nach Herausforderung, an der Blinddarm Patch, gefolgt von Progression zu distalen Kolon 2 bis 3 Tage nach der Infektion 3. Bei immunkompetenten Maus-Stämmen ist Clearance des Erregers 3 bis 4 Wochen nach der Infektion 1,3,4 erreicht. Allerdings sind viele genetisch veränderte Stämme, zB Gen defizient oder Knockout-(- / -)-Mäusen wurden, gefunden worden, um anzuzeigen Increased Infektionsanfälligkeit was zu Schäden übertrieben und / oder chronischen Infektion und Entzündung 9-14. Mit der Benutzung dieser infektiöse Kolitis Modell in dieser Knockout-Stämme, viele fehlen angeborenen Signalproteine, wurde bei der Aufdeckung mehrerer Wirtsproteinen integraler Bestandteil Auflösung von Darm-Infektion und Entzündung unverzichtbar.

Protocol

Ein. Vorbereitung der Citrobacter rodentium Inokulum und orale Gabe von Mäusen Vorbereiten und autoklavieren Luria Bertani Broth (LB). Erhalten lebensfähigen C. rodentium aus einem gefrorenen Glycerin Lager und streifenfrei auf LB-Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Pipettenspitze. Bei 37 ° C über Nacht. Beimpfen 3 ml steriler LB Brühe in einen Falken Kultur Rohr mit Kolonien von der LB-Platte mit einer Impföse oder Pipettenspitze. Vorbereitung des Inokulums sollte m…

Representative Results

Während einer Standard-Infektion Experiment werden Mäuse mit ca. 2,5 x 10 8 CFU durch eine Magensonde von 100 ul Nacht C. infiziert rodentium Kultur. Infektion von C57BL / 6 Mäusen mit C. rodentium Ergebnisse in bescheidenen und vorübergehenden Gewichtsverlust und Durchfall. Obwohl ein seltenes Ereignis mit C57BL / 6 Mäusen, können die Tiere krank werden und erfordern Euthanasie. Daher sollten Mäusen Grad der Gewichtsverlust und Symptome von Stress, wie piloerect Fell und gek…

Discussion

Citrobacter rodentium Infektion stellt ein geeignetes Modell für die Untersuchung von sowohl infektiösen Krankheit und Colitis bei Mäusen. Diese einzigartige Modell erlaubt die Charakterisierung von Host Reaktionen sowie der pathogenen Eigenschaften der Bakterien. Die beschriebenen Schritte in diesem Protokoll detailliert die erfolgreiche Anwendung dieses Modells.

Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll im Auge zu behalten, wenn induzieren ulcerosa und Analyse Antwo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse für BAV von der Morbus Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) und der Canadian Institutes for Health Research (CIHR) unterstützt. GB wurde von einem Diplom-Stipendium aus CIHR finanziert. BAV ist die Kinder mit Darm-und Leber-Erkrankungen (CHILD) Foundation Chair of Pediatric IBD Forschung und Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Luria Broth ABM G247 Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using.
Square bottom plate with grid Fisher 08-757-11A
Falcon culture tube Sarstedt 62.515.006
Bulb tipped gastric gavage needle Fine Science Tools 18060-20
1 ml syringe BD Biosciences 309659
4 kDa FITC-dextran Sigma FD-4
Citric acid Sigma C7129
Sodium citrate Fisher S279-500
Dextrose Fisher D16.1
Acid citrate dextrose 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose
Black 96-well plate Fisher 07-200-762
Metal beads (5 mm) Qiagen 69989
10% formalin Fisher 5F93-4
5 ml vial DiaMed STK3205
Hematoxylin Fisher H345-23
Eosin Fisher E511-100
Xylene Fisher HC700-1GAL
Tween 20 Sigma P5927
Coplin staining jar VWR 47751-792
Sodium citrate buffer 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0
Pap pen Cedarlane Mu22
Goat serum Sigma G902-3
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP1600-100
Triton X-100 Sigma T8532
Sodium azide Sigma SZ002
Blocking buffer 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C.
Antibody dilution buffer 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA
Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20)
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen P-36931
Coverslips Fisher 12.54SE
Benchtop incubation shaker Barnstead Lab Line Max Q4000
Fluorometer Perkin Elmer Victor2D
Refrigerated centrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R
Steamer Black & Decker
Fluorescence microscope Zeiss Axio Image.Z1

References

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Bhinder, G., Sham, H. P., Chan, J. M., Morampudi, V., Jacobson, K., Vallance, B. A. The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis. J. Vis. Exp. (72), e50222, doi:10.3791/50222 (2013).

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