Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

Summary

Determinando o enxerto de células do doador representa um desafio em ratinho ósseas modelos de transplante de medula que carecem bem definidos marcadores fenotípicos. Nós descrevemos uma metodologia para quantificar o enxerto de células de doadores do sexo masculino em camundongos fêmeas receptoras de transplante. Este método pode ser utilizado em todas as estirpes de ratinho para o estudo de funções HSC.

Abstract

Murinos osso modelos de transplante de medula fornecer uma ferramenta importante na medição de células-tronco hematopoiéticas (HSC) funções e os genes que determinam / moléculas que regulam HSCs. Nestes sistemas modelo de transplante, a função de HSCs é determinada pela capacidade destas células para enxertar e reconstituir ratinhos receptores letalmente irradiados. Comummente, a célula doadora contribuição / enxerto é medida por meio de anticorpos específicos para o doador de proteínas da superfície celular, utilizando citometria de fluxo. No entanto, este método depende muito da especificidade e a capacidade do marcador de superfície celular de diferenciar células derivadas de dador a partir de células-receptor originadas, que podem não estar disponíveis para todas as estirpes de ratinho. Considerando os vários fundos de linhagens de camundongos geneticamente modificados no mercado, esta superfície celular / citometria de fluxo baseado em método tem limitações significativas, especialmente em linhagens de camundongos que não têm bem definidos marcadores de superfície de células de doadores separar Congênicos destinatário cells. Aqui, nós relatamos uma técnica baseada em PCR para determinar o enxerto de células do doador / contribuição em camundongos receptores de transplantes. Nós transplantadas machos dadores de medula óssea para HSCs letalmente irradiados congénicos ratinhos fêmea. Amostras de sangue periférico foram colhidas em diferentes pontos do tempo pós-transplante. As amostras de medula óssea foram obtidas no final das experiências. O ADN genómico foi isolado e o gene cromossoma Y específica, Zfy1, foi amplificado utilizando PCR quantitativa em tempo real. O enxerto do doador masculinos derivados de células nos ratinhos receptores do sexo feminino foi calculado contra curva padrão com a percentagem conhecida de DNAs macho versus fêmea. Bcl2 foi usado como um gene de referência para normalizar a quantidade total de ADN. Os nossos dados sugerem que esta abordagem fiável determina o enxerto de células do doador e proporciona um método útil, contudo simples para medir a reconstituição de células hematopoiéticas, em modelos de transplante de osso murino medula. O nosso método pode ser realizado rotineiramente em muitos laboratórios, porque nenhumequipamento caro, tais como citometria de fluxo é necessária.

Introduction

Murino de medula óssea (BM) modelo de transplante foi desenvolvido pela primeira vez em 1960 ^1. Este modelo tem sido utilizado extensivamente para o estudo do dador de células estaminais hematopoiéticas (HSC) Biologia em um rato receptor hospedeiro. Murino osso modelo de transplante de medula nos proporcionou conhecimentos valiosos sobre as funções do HSC e sua regulação e é indispensável na pesquisa HSC. Alogénica modelo de transplante de medula óssea como C57Bl/6J ^H2b-Balb / C ^H2d ou modelo de transplante Congênicos como C56Bl/6J ^{CD45.2-B6.SJL CD45.1} são usados ​​em muitos laboratórios, para estudar a função de genes em actividade HSC ^2, efeito de tratamento com medicamentos para as doenças de função HSC ³ ou afins, tais como o transplante de enxerto-versus-hospedeiro (GVHD) ^4.

Marcadores de superfície celular tais como o haplotipo MHC ou CD45.1 são comumente usados ​​para distinguir células derivadas de dador de células-receptor originaram. C57Bl/6J ^{H2b, CD45.2} </sup>, Balb / C e ^H2d B6.SJL ^CD45.1 são as estirpes de ratos mais utilizados no transplante de medula óssea porque a contribuição das células do doador podem ser facilmente avaliadas por citometria de fluxo, medindo CD45.1 vs CD45.2 ou H2b vs H2D. No entanto, muitas outras cepas, como FVB / NJ ⁵ e C3H também são frequentemente utilizados para gerar transgênico ou geneticamente camundongos knockout. Estes ratos podem ser retrocruzada com uma linha pura e mantidos num fundo genético / MHC misto. Nestes casos, determinar o enxerto dador de células e função HSC pode ser difícil como marcadores específicos de dadores de células superficiais podem não estar disponíveis.

Usando Y-cromossoma sonda específica de DNA para detectar as células de doadores do sexo masculino por Southern blot em sexo incompatíveis transplante de medula óssea foi desenvolvido pelo grupo do Dr. Miwa ^6. Em seguida, um PCR em tempo real para a região Y-sexo determinação verificou-se ser um método preciso e altamente específico para quantificar macélulas fetais le no sistema de sangue materno ^7. Este conceito foi adaptado pelo grupo do Dr. Schwarzenberger para o desenvolvimento de uma técnica de PCR em tempo real em um modelo murino de transplante de medula óssea para determinar o enxerto doador de ⁸ células. Nós ainda modificada deste método para a medição do enxerto dador de células no modelo do rato FVB / NJ transplante de medula óssea. Este método é actualmente utilizada extensivamente no nosso grupo para o estudo do papel da quinase Pim1 em biologia HSC.

Protocol

1. Isolamento das células da medula óssea Euthanize masculinas dadoras FVB / NJ ratos fêmeas e FVB / NJ camundongos utilizando CO método 2, seguido de deslocação cervical. As fêmeas FVB / NJ células da medula óssea será utilizado como células competitivos. Use pequenas tesouras e pinças, dissecar fêmures e tibiaes de ratos e coloque-os em um prato de 60 milímetros de cultura de tecido contendo 6 ml RPMI1640 gelada com 5% de calor FBS inativado. Use tecido Kimwipe para remove…

Representative Results

Figura 1 e 2 apresentaram exemplos de curvas padrão traçada com valores médios de 2-δCt contra percentagens de ADN masculino. Figura 1A mostraram temperatura de fusão específica para Bcl2 e Zfy1 amplicons localizadas a 78,5 ° C e 88,5 ° C, respectivamente. Bcl2 é utilizado como um gene de referência para normalizar a quantidade total de ADN carregado em cada reacção de PCR. Bcl2 curvas de amplificação (ver Log) para cada amostra, padrão fundem uns com os outros…

Discussion

O objetivo de nosso estudo é o de fornecer as audiências uma técnica de PCR baseado quantificar o enxerto de células de doadores em um modelo murino de osso competitivo transplante de medula. Vários estudos têm sido relatados por meio de RT-PCR para detectar as células de dadores em modelos de transplante ^9-10. O grupo do Dr. Schwarzenberger a primeira desenvolveu um modelo murino óssea transplante de medula usando PCR em tempo real para amplificar cromossomo Y específico ^8. Este método f…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Heat inactivated
Ammonium chloride	MP Biomedicaals	194806
Potassium Bicarbonate	Fisher	P184-500
QIAamp DNA Blood minikit	Qiagen	51106
Cell strainer	BD bioscience
iQ SYBR Green supermix	Biorad	170-8882
iQ5 real time PCR machine	Biorad
Spectra photometer	Nanodrop ND-1000	ND-1000