Optogenetic Стимулирование Побег поведения в<em> Дрозофилы</em
Summary
Генетически закодированный инструменты optogenetic позволяет неинвазивным манипуляции конкретных нейронов в<em> Drosophila</em> Мозг. Такие инструменты могут определить нейроны, активации достаточно, чтобы вызвать или подавить частности поведения. Здесь мы представляем метод для активации Channelrhodopsin2, что выражается в целевых нейронов в свободно гуляющих мух.
Abstract
Все большее число генетически закодирована инструменты становятся доступны, которые позволяют неинвазивным манипуляции с нейронной активности специфических нейронов дрозофилы 1. Главными среди них являются optogenetic инструменты, которые позволяют активации или глушителей конкретных нейронов в нетронутой и свободно движущихся животных с использованием яркого света. Channelrhodopsin (ChR2) является светло-активированных катионов канал, который при активации синий свет, вызывает деполяризацию нейронов, что выразить это. ChR2 была эффективна для выявления нейроны важны для конкретного поведения, такие как CO 2 избегания, хоботок расширение и гигантские волокна опосредованная реакция испуга 2-4. Однако, как яркие источники света используются для стимуляции ChR2 также стимулировать фоторецепторы, эти optogenetic методы ранее не были использованы в зрительной системе. Здесь мы объединяем optogenetic подход с мутацией, которая ухудшает фототрансдукции для демонстрацииnstrate, что активация кластера ткацкий станок-чувствительных нейронов в оптической доле мухи, Фома-1 нейроны, может управлять поведением побег используется, чтобы избежать столкновения. Мы использовали нулевой аллель из важнейших компонентов фототрансдукции каскада, фосфолипазы C-β, кодируемого геном norpA, оказывать летит слепым, а также использовать Gal4-UAS транскрипционных активаторов системы для управления экспрессией ChR2 в Фома-1 нейронов. Индивидуальные мух помещают на небольшой платформе окружении синих светодиодов. Если светодиоды горят, летит быстро взлета в полете, подобно визуально приводом станка-выход поведения. Мы считаем, что этот метод может быть легко адаптирована для изучения других поведения в свободном перемещении мухи.
Introduction
Растущий арсенал генетически закодирована инструменты были разработаны для работы нейронной активности в отдельных клетках дрозофилы 1. Эти инструменты позволяют неинвазивной активации или глушителей конкретных нейронов в нетронутой и свободно движущихся животных. Среди них Channelrhodopsin2 (ChR2), светло-активированных катионов канал, предлагает основные преимущества, так как он может быть временно управлять и быстро индуцированной. Когда нейроны, которые выражают ChR2 подвергаются ярко-синий (470 нм) света они быстро деполяризовать и обладают повышенной теплотехнической 3-5. Такие целевые активации специфических нейронов в свободном перемещении животных показали достаточность частности нейронов поведения, такие как CO 2 избежании 3, хоботок расширения 2,4, и гигантские волокна опосредованный ответ испуга 4. Однако, как интенсивный источник света необходимо стимулировать ChR2 также стимулировать фоторецепторы, применяя опtogenetic методов зрительной системы была ограничена. Объединив optogenetic подход с мутацией, которая ухудшает фототрансдукции, мы показали, что активация конкретного кластера нейронов в оптической доле мухи может управлять поведением побег используется, чтобы избежать столкновения 6.
Большинство, если не все, визуально животные проявляют побег поведение, чтобы избежать столкновения с встречным объектов. Ходьба или стационарного мух, когда представлены надвигающегося столкновения, взлет в полете, от встречного столкновения 7-9. Эти взлетов характеризуется поднятыми крыльями до взлета и неустойчивую траекторию полета 10,11. Эта реакция отличается от гигантского волокна опосредованной реакции испуга, прыжки, которые не предшествовали поднятыми крыльями, и обычно приводят в свободном падении падение 4,9. После определения конкретного кластера ткацкий станок чувствительных нейронов в зрительных долей, Фома-1 нейроны, которые uniquЭли настроен для кодирования приближается объектов, мы стремились исследовать их участие в ткацком станке поведения побег мухи. Здесь мы демонстрируем использование optogenetics выборочно активировать эти нейроны и вызывает бегство поведение мухи.
Мы используем Gal4-UAS транскрипционных активаторов системы управления экспрессией ChR2 в Фома-1 нейроны. ChR2 требует кофакторов все-транс-ретиналь и как этому можно найти в низких уровнях в Drosophila центральной нервной системы, оно должно быть дополнено в рационе мух. 3,4 Как яркий свет используется для активации ChR2 и мухи проявляют сильное поведение phototactic 12, мы стремились исключить возможность визуального ответ на стимул. Для этого мы использовали животных, которые были гомозиготных мутантных по нулевой аллель гена norpA, который кодирует одним из важнейших компонентов фототрансдукции каскада, фосфолипазы C-β. Фоторецепторов в таких мутантных мух не могут ответственD на свет 13. Чтобы проверить optogenetic стимуляции побег ответ, мы должны изолировать одну муху и купать его в ярко-синим светом. Чтобы сделать это, мы размещаем отдельные мухи в пипетки советов. Одна пипетка головка помещена в специально держателя, так что муха будет geotactically ходить кончик и выходит на прямоугольной платформе. Муха может свободно ходить на вершине этой платформы. Платформа окружен четырьмя синий светодиод массивов, каждый из которых содержит 3 светодиода, ориентированных на верхней части платформы. После того, как муха на платформе, светодиоды горят, и ответ мухи записывается с помощью высокоскоростной камеры 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы показали, optogenetic стимуляции побег поведения, купаясь свободно гуляющих мух в ярко-синий свет. Этот подход может быть легко адаптирована для изучения поведения в других свободно гуляющих мух, и можно масштабировать до больших платформ просто плитка светодиодных массивов мы испол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась стипендий Стэнфордского Дин (SEJdV), Национальные институты здравоохранения Pioneer Award директора (TRC DP0035350), премии Фонда Мак-Найт ученого (TRC) и R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
