우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을 제시<em> Caenorhabditis elegans</em> 지질 상점. 형광 지질 비말 이미징을위한 신속하고 간단 고정 – 얼룩 절차는 lipophilic 염료 나일강 붉은 색의 스펙트럼 특성을 활용합니다. 우리는 트리글리세리드 및 고체 위상 추출 및 기체 크로마토 그래피 – 질량 분광법을 사용하여 phospholipids의 생화학 측정을 제시한다.
선충류 C. elegans은 인간의 비만과 관련 pathologies와 관련된 지방 신진 대사를 조절 보존 유전자 경로의 연구에 중요한 모델로 등장했다. C.의 시각화를 위해 개발 된 여러 가지 이전 방법 elegans 트리글리 세라이드이 풍부한 지방 상점 지질 방울 이외의 다른 세포 구획을 강조, 잘못된 것으로 입증되었습니다. 다른 방법은 특수 장비를 필요로 시간이 많이 걸리는, 또는 일관성 결과를 얻을 수 있습니다. 우리는 C.의 중성 지질 방울의 정확하고 빠른 탐지를위한 급속한, 복사, 정착액 기반 나일 붉은 착색 방법을 소개합니다 elegans. 40% 이소프로판올의 짧은 고정 단계는 동물을 얼룩하는 데 사용됩니다 나일 빨강, 완전히 투과 동물을합니다. 이 lipophilic 염료의 스펙트럼 특성은 강력하고 선택적으로 노란색 – 녹색 스펙트럼 형광을 할 수 있도록하는 경우에만 지질이 풍부한 환경에서,하지만 작품극지 환경. 따라서, 지질 방울은 이소프로판올 만 간단한 나일 붉은 착색 단계 후 간단한 GFP 이미징 기능을 갖춘 형광 현미경에 시각화 할 수 있습니다. 속도, 경제성,이 프로토콜의 재현성은 이상적으로 높은 처리량 화면에 적합합니다. 우리는 또한 트리글리세리드 및 가스 크로마토 그래피 질량 분석계를 사용하여 – phospholipids의 생화학 결정에 대한 페어링 방법을 보여줍니다. 이 더 엄격한 프로토콜은 나일 강 빨간색 미세 지질 결정에서 얻은 결과의 확인으로 사용되어야합니다. 우리는이 기술이 C. 분야에서 새로운 표준이 될 것으로 예상 elegans 대사 연구.
인간과 선충류의 Caenorhabditis elegans의 사이에 신진 대사 경로의 보존은 비만 연구를위한 강력한 모델 생물 수 있습니다. 동안 C. elegans는 포유류에서 같은 지방 저장에 전념 adipocytes가 없습니다, 그들은 지질 방울 1 점 트리글리세리드을 수행하고 지방 저장 및 에너지 사용 2,3의 동일한 규제의 많은 부분을 가지고 있습니다. C.에 지방 수준에 대한 분석에 elegans는 여러 가지 방법이 쉽고 성공의 다양한 수준과 제안되었습니다. 형광, 중요한 염료 4-7의 한 일반적인 사용은 최근에 달려 있으며,이 시약은 C.의 주요 지방 저장 창고에서 뚜렷한 구획을 얼룩 질에 입증되었습니다 elegans 1,8-11. 이러한 수단 검은 색과 오일 빨간 O와 같은 고정력있는 기반이 아닌 형광 염료, 웜 12-14에 지질 방울을 강조에 성공 fluores 등의 quantitation에 대한 큰 동적 범위로하지 않지만센트 염료 8,13,15. 또한, 형광 및 비 형광 모두 염료에 대한 고정의 현재 방법은 시간이 오래 걸릴 수 있으며 여러 냉동 해동 단계 및 / 또는 독성 화학 물질 1,9,10의 사용을 포함한다. 특정 BODIPY – 표시 지질 analogs의 사용은 단기 라벨 15 웜을 생활에 공급되면 지질 방울을 강조하는 것으로보고되었습니다. 그러나이 염료의 이해에 의존하기 때문에 C.에 의해 바이어스된다 BODIPY 지방산 analogs의 elegans 처리 및 신진 대사. 지질 착색 염료에 설립 된 대안은 지방 점포에게 10,16을 시각화하는 지질 분자의 특성 진동 특성을 활용 레이블이없는, 일관된 반 스톡스 라만 산란 (자동차) 또는 자극 라만 산란 (SRS) 현미경,이다 17. 그러나, 고가의 전문 장비는이 방법에 필요한이며, 처리량은 기껏 낮습니다.
빠른, 확장 성 analy에 대한 필요성을 충족하려면C.의 중성 지질 상점 언니 elegans 신진 대사 연구는, 우리는 정착액 기반 나일 붉은 지질 착색의 높은 재현 방법을 소설을 소개합니다. lipophilic 염료 나일 붉은 색의 스펙트럼과 물리 속성은 경우에만 지질이 풍부한 환경에서,하지만 더 많은 극지 환경 18에 녹색 발광 스펙트럼 형광을 할 수 있도록, 그 여기 – 방출 피크에서 노란색 – 금 스펙트럼 변화를 유도 19. 따라서 지질 방울은 형광 현미경에 대해 설정된 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터의 사용에 의해 간단하게 염색 한 후 검색 할 수 있습니다. 이 기술의 편리함과 경제성이 이상적으로 높은 처리량 화면에 적합합니다. 우리는 또한 트리글리세리드와 견고한 위상 추출 및 기체 크로마토 그래피 – 질량 분광법을 사용하여 phospholipids의 생화학 결정에 대한 쌍, 엄격한 방법을 보여줍니다. 생화학 지질 측정 C.의 나일 붉은 기반의 미세한 결정과 상관 관계 elegans FAt 질량과는 미세 지질 결정으로 만든 연구 결과의 확인으로 사용되어야합니다.
제시 프로토콜은 C.의 지질 수준의 신속하고 대규모 검진을 허용 쉽게 높은 처리량 화면에 적용 할 수 elegans. 여러 동결 – 해동 사이클 8,10 다음 paraformaldehyde의 긴 고정 단계를 포함 이전에 사용한 방법과 달리, 우리의 프로토콜은 이소프로판올에서 간단한 3 분 고정이 필요합니다. 우리는 발견 한 그 C. 얼룩으로 40% 이소프로판올의 elegans, 그들은 추가 냉동 해동 또는 고정 단계를 사용하지 않고, 나일 빨간색으로 자유롭게 투과된다. 나일 빨간색 선택적으로 녹색 스펙트럼 18,19,31의 소수성 구획에 fluoresces으로도, 더 destaining이 필요하지 않습니다. 총, 동물 불과 2.5 시간에 스테인드와 준비가 이미지 동물 RNAi 판에서 촬영 할 수 있습니다. 이 방법은 상대적으로 저렴하고 높은 재현성과 수행 할 수 있습니다. 방법은 C.의 능력에 의존하지 않습니다 이해하거나 집중하는 elegans따라서 염료,하고 중요한 염료를 사용하여 기반 방법을 먹이와 같은 제한이 없습니다. 재현성 및 측정의 정확성을 감안할 때, 방법은 RNAi에 의해 유전자 inactivations 많은 수의 검사에 적합합니다. 지질 수준의 quantitation이 고착 력있는 나일 붉은 착색에 따라 필요하다면, 우리는 생물은 해당 컨트롤 및 적용 통계 테스트를 복제 4-6의 사용을 권장합니다.
이 작은 동물로 이어지는 많은 유전자 inactivations (지연되거나 체포 개발을 일으키는 RNAi의 클론으로 인해)는 관계없이 지방의 신진 대사에 어떤 연결, 지방 당국의 화면이 나오는 것을 가능성이 높습니다. 우리가 웜 영역으로 형광 강도를 정규화하여 다양한 크기의 벌레에 대한 계정을 이용하여 이미지 분석 프로그램을하는 동안 각각의 연구자도 비슷한 발달 단계의 야생 형 동물 작은 동물의 지방 착색 수준을 비교하는 것이 좋습니다. 의명백한 저지방 대량으로 작거나 발달 체포 동물의 경우, 우리는 단일 양상이 변경된 지질 대사를 입증하기에 충분하지 않습니다하는 것이 좋습니다. SPE-질량 분석기로 분석해 등 여러 가지 후속 실험은, 이러한 유전자의 지질 규제 기능을 확인할 필요 할 수있다. 알려진 신진 대사 조절에 대한 fasn-1, SPE-질량 분석기로 분석해 분석 발달 일치 N2 L2 제어 동물에 비해 것은 성인 제어 동물에 비해 발견 된 명백한 저지방 표현형을 확인하기 위해 필요했다. 나일 빨간색 지방의 착색이 무대 일치 L2 제어 RNAi 동물에 비해 성인 RNAi를 제어 할 상대 낮은 지방 수준을 표시하지만, 더 명백한 차이는 볼 수 없습니다. 따라서, fasn-1 RNAi는 무대 일치 L2 제어 RNAi 동물의 생화학 적 구별하므로 fasn-1이, 지방 질량의 진정한 레귤레이터인지 확인하기 위해 두 번째 방법을 필요 TAG / PL 비율의 예 생화학 정량화를했습니다 사용합니다.
<p c아가씨 = "jove_content"> 우리는 높은 처리량 플랫폼을위한 이미징 및 가공을 제시하지만, 종래의 직립 현미경이 쉽게 아가로 오스 패드 20 일 또는 테플론 인쇄 종래의 사이즈에 장착 웜에서 이미지를 캡처하는 데 사용할 수있는 8-12 아니라 현미경 슬라이드 . 유일한 제한은 빠르게 나일 붉은 photobleaches 물들 지질 방울의 녹색 형광으로 체계적인, 균일 한 노출 조건 이미지 사이에 comparability을 보장하기 위해 사용해야한다는 것입니다. 우리는 균일 한 이미지 수집 조건에 완전히 자동화 된 현미경이 효과에 가장 적합한 것을 알게됩니다.이 프로토콜의 위대한 장점 중 하나는 이미지가 수집 된 후 그들은 다시 분석 미래를 위해 저장 될 수 있다는 것입니다. 동일한 이미지가 지방 콘텐츠를 제공 할뿐만 아니라 몸 크기를 결정하는 데 사용 될 수 있습니다. 계산 프로그램 고급 될 때 또한, 통계적으로 의미있는 결과를 생성, 단일 웜 분석을위한 전망이하나의 잘에서. 따라서 높은 처리량 현미경을 이용하여 우리의 방법은 형광 신호를 32,33을 수량화하기 위해 Copas Biosort를 사용하여 게시 화면 방법론을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 방법론은 확실히 무료입니다.
SPE 및 GC / MS에 의한 지질의 콘텐츠 정밀, 생화학 결정은 C.의 주요 지방 점포의 나일 붉은 얼룩을 확인 elegans. 정착액 나일 붉은 착색 및 생화학 지질 결정에서 달성 절대 quantitation은 종종 완벽하게 일치하지 않지만, 두 가지 방법이 질적 동의 높은 재현, 통계적으로 의미있는 결과를 생산하고 있습니다. 또한이 방법은 glycosphingolipids, phospholipids, 또는 다양한 샘플에서 트리글리세리드 존재하는 별도의 클래스의 추가 분석이 필요할 수 있습니다 개별 연구자의 특정 요구를 충족하도록 맞춤 할 수 있습니다. 그것은 다른 그룹 기술 다른 THA를 사용한 것을인지해야합니다N SPE는 GC / MS 22 전에 지질 클래스를 분리합니다. 얇은 층 크로마토 그래피 (TLC)와 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC)는 사람들이 (phosphatidylcholine, 극성 지질의 더 나은 별도의 구분 중성 지질 (예 : TAG, diacylglycerols, 무료 지방산 및 콜레스테롤 에스테르) 할 수있을 점에서 SPE 이상의 장점이 있습니다 phosphatidylethanolamine)과 글리콜 – sphingolipids. 이 물질 (2,500-5,000 웜)를 시작 최소 요구하기 때문에 우리는 SPE 선택은 중성 지질 분획 4의 대부분을 구성하는 주요 장기 에너지 저장, 태그를 강조하고, 빠른 속도이며, 더 전문적인 장비를 필요로하지 않거나 접시. 이것은 표준 혼합물에 따라 점을 강조해야 SPE는 완전히 PLS에서 태그를 분리하고, (그림 5A 참조) 높은 재현하고 신뢰할 수 있습니다. 지방산 메틸 에스테르의 quantitation 및 분석은 GC / MS을 필요로하지만,이 장비는 일반적으로 이용이 가능하며, 그렇지 않으면 로컬, 샘플 수도 있습니다위와 같이 생성하고 공동 작업자 또는 상업적 GC / MS 서비스에 의해 분석이 배치 될 때까지 -80 ° C에서 질소에 저장됩니다.
질량 분석기로 분석해 출력은 각 지질 종의 각 지방산의 고해상도 데이터를 포함합니다. 이 비교 샘플 사이의 자세한 차이점 결정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 탐정은 특정 지방산의 수준 DAF-2, LPD-3 fasn-1 RNAi 대 벡터 제어에서 다른 사람보다 훨씬 풍부하게 변경되었는지 여부를 확인할 수 있습니다. 이 엄청난 강력한 도구 따라서 지질 종은 어떤 실험 조작 풍부하게 변경되는에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.
우리의 분석을 위해, 우리는 가장 자주 PL 질량에 TAG 질량을 정상화. 단백질이나 DNA도 sonicated 웜 펠릿의 나누어지는의 결정에 따라 지질 질량을 정상화하는 데 사용할 수 있지만, 이러한 방법 INT 될 수 있습니다 것을 발견모든 pipetting 단계에서 각 추출에서 샘플 복구에 roduced 인간의 오류가 발생합니다. 우리가 대신 우리의 정규화 요소로 PL 질량을 사용하도록 선택한 이러한 이유에서입니다. 부 자연스러운 표준 프로토콜의 시작 (TAG에 대한 tritridecanoin, 1,2 – diheptadecanoyl-SN-glycero-3-phospho – (1'-RAC-글리세롤) PL에 대한)에 도입 된 고체 위상 추출의 단계를 수행하고 명성 준비, TAG 및 PL의 분수 모두의 양적 및 대표 복구를 보장합니다. 조사관 TAG 질량을 정상화하기 위해 단백질이나 DNA를 사용하는 경우 동일한 보장 할 수는 없습니다. 우리는 PL이 샘플에서 TAG 수준을 비교하는으로 가장 강력한 게이지 할 생각이 이전에 PL 만 일분 TAG 수준, 예를 들어 확장 기아의 대형 질량 변화를 effecting 같은 자극에 의해 변경 또는 운동을 34 증가하는 것으로 나타 되었기 때문에 – 36. PL은 막 유동성 및 셀룰러 inte을 보장, 구조 역할을 것으로 생각되고grity하고 오히려 에너지 저장 37-39로보다 신호 역할. 손에서 TAG / PL 비율이 가장 가까운 나일 붉은 색과 정착액 기반 지질 착색 얻은 무엇 일치하고, 다른 그룹 21에 의해 발견과 함께 동의합니다. 다른 전략은 지질 TAG의 비율이 총 지질 9,22,29 비해 계산됩니다 와츠 연구소에 의해 사용됩니다.
TAG 및 PL 표준이 아닌 기본 형식의 사용은 기본 지방산이 정상화 계산에 포함되지 않습니다 보장합니다. 체인 길이의 선택은 순전히 기본 지방산의 질량 스펙트럼에 영향을주지 다음 표준의 필요성에 기반을두고 있습니다. 우리는 13시와 17시의 지방산이 목적에 가장 역할을하는 것으로 확인되었습니다. 우리 부 자연스러운 지방산 표준은 모든 체인 길이 지방산 또는 비교와 체인의 복구를 대표하지 않을 수 있다는 짧은 사슬 지방산의 서로 다른 화학 속성을 주어진 수 있습니다erent 포화 지표. 따라서이 SPE 또는 질량 분석기로 분석해 동안 우리가 정화 또는 다른 체인 길이의 지질 사이 검출의 효율성의 차이를 볼 수 가능성이 있습니다. 이것과 질량 분석기로 분석해에서 다른 지방산의 다른 이온화를 바탕으로, 그것은 특정 지방산의 풍부한에 대한 절대 성명을 발표 할 수 없습니다. 따라서, 우리는 특정 지방산의 단일 실험 abundances에서 샘플 사이의 비교합니다. 사람이 절대적으로 한 방식으로 지방산을 quantitate하기를 원한다면 이것은이 될 수 있도록, 위의 그 또는 이와 유사한 지방산의 안정적 isotopically 표시 13 C 버전의 알려진 양의 마약을 준비 예제를 실행하는 것입니다 달성 할 수 예를 들어, MSD의 부모 이온의 질량에 따라 구별. 우리가에만, 비용의 최소 지질 클래스의 상대적인 양 또는 특정 지방산을 우리 13시 TAG와 17시 PL 표준이 적절하게이 목적을 위해, 비교되는 감안할 때각 지질 클래스의 적절하고 대표 복구를 보장합니다.
이 시점까지, 다양한 방법론에 의해 얻어진 특정 결과의 해석,와 일반적인 방법론이 있어야 무엇인지 합의의 부족이있었습니다. 전체 그것은 고립에 아무도 방법이 이상적 C.의 지방 신진 대사를 공부하기 적합하지 않습니다 것을인지해야합니다 elegans. 그러나, 여러 검사 및 검증 modalities를 사용하여, 하나는 지질 규제 유전자를 획득 데이터에 대한 자신감을 얻을 수 있습니다. 우리 프로토콜 C. 분야에서 미래의 작업에 대한 벤치 마크 역할을 할 따라서, 우리는 예정 elegans 지방 연구.
The authors have nothing to disclose.
우리는 토론 및 원고를 읽기 위해 기술 지원 및 Lianfeng 우에 마이클 Kacergis 감사드립니다. 이 작품은 NIH / NIDDK (AAS에 K08DK087941), NIH / NIDDK 훈련 보조금 (ECP로 5T32DK007028), 노화 상 (AAS까지)에서 엘리슨 의료 재단 뉴 학술 및 찰스 H에서 경력 개발 상에 의해 지원되었다 . 후드 재단 어린이 건강 연구 상 (AAS까지).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin replicator | Nunc | 250520 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Agar | US Biologicals | L1500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Agarose | Invitrogen | 16500500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Mechanical Pipettors | Biohit M Line | M10, M100, M300 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Electronic Pipettor | Biohit E Line | E1200 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M KH2PO4 | Sigma | P0662 | pH 6.0 Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M MgSO4 | Sigma | M2643 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M CaCl2 | Sigma | C2661 | Sterilized by Autoclaving | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaCl | Sigma | S5886 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Cholesterol | Sigma | C8667 | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
200 mg/ml Carbenicillin | US Biologicals | C1100 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 M IPTG | US Biologicals | I8500 | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100 mg/ml Ampicillin | Filter Sterilized 0.2 μ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5 mg/ml Tetracycline | In 100% Ethanol | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bacto Agar | BD | 214040 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well TC Plates | BD-Falcon | 353072 | For 96-well RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rectangular A/T Plates | Thermo Scientific | 242811 | For stamping RNAi | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LB Media | US Biologicals | L1530 | Prepared as per manufacturer instructions | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Deep Well Assay Blocks | Corning | Costar 3960 | Rectangular V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Shallow Well Assay Block | Corning | Costar 3956 | Round V-bottom assay block | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sterile Sealing Film | VWR | 89134-432 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aluminum Sealing Film | Corning | Costar 6570 | Thermowell Sealing tape for 96-well plates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
M9 Buffer | See Hope et al.20 | See recipe below | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-0407 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nile red | Invitrogen | N-1142 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Isopropanol | Fisher | BP2632-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-pin aspirator | VP Scientific | VP177A-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Teflon Masked Microscope Slides | Thermo Scientific | Custom | Can also order Trevigen 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
96-well Gold-Seal Coverslides | Thermo Scientific | Custom | Can also use second 96-well Cometslide | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deep-well PCR plate | VWR | 89049-178 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-sterile adhesive film | VWR | 60941-070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
High-Throughput Microscope | Leica | DM6000 fully automated with Prior 96-well stage | With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bath Sonicator | Diagenode | Bioruptor XL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Chloroform | Sigma | 366927-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Methanol | Fisher | Optima F456-4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phospholipid Standard | Avanti Polar Lipids | 830456P | 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triglyceride Standard | NuChek Prep | T-135 | tritridecanoin | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Wiretrol 50 μl Pipet | Fisher | 21-176-3A | Drummond Scientfic | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Acetone | Sigma | 320110-4L | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sulfuric Acid | Fisher | A300-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hexane | Fisher | Optima H306-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SPE Silica Column | Thermo Scientific | 60108-317 | Hypersep SI, 100 mg resin bed | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Solid Phase Chromatography Manifold | Sigma | 57265 | Supelco Visiprep 24-DL | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pipets | Fisher | 13-678-27F | 10 ml size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-8B | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Borosilicate Culture Tubes | Fisher | 14-961-27 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Threaded Borosilicate Tubes | VWR | 14235-460 | 8 ml capacity | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Phenolic Caps for Culture Tubes | Fisher | 14-823-211 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS Autosampler Vials | Agilent | 5188-6592 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Caps for Autosampler Vials | Agilent | 5185-5861 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC/MS | Agilent | 6890 GC / 5973 MSD | Outfitted with a Supelcowax-10 column | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:
Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:
LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy. 100 mg/ml Ampicillin Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Tetracycline Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container. 200 mg/ml Carbenicillin Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. 5 mg/ml Cholesterol Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months. 1 M MgSO4 Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M CaCl2 Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. 1 M KH2PO4, pH 6.0 Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature. M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature. 10 N NaOH Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature. 1 M IPTG Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use. Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use. Nile red stock solution Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner. Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use. Phospholipid Standard Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. Triglyceride Standard Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year. |