Primaire muis cardiomyocytkweken is een van de cruciale instrumenten voor het onderzoek myofibrillar inrichting en functie. Het volgende protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van primaire cardiomyocyten van neonatale muis harten. De resulterende cardiomyocytkweken kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van biomechanische, biochemische en celbiologische assays.
Gekweekte neonatale hartspiercellen al lang gebruikt om myofibrillogenesis en myofibrillar functies te bestuderen. Gekweekte hartspiercellen zorgen voor een gemakkelijke onderzoek en manipulatie van biochemische pathways, en hun effect op de biomechanische eigenschappen van spontaan slaan hartspiercellen.
De volgende 2-daagse protocol beschrijft de isolatie en de cultuur van neonatale muis hartspiercellen. We laten zien hoe je de harten gemakkelijk ontleden van pasgeborenen, distantiëren het hartweefsel en verrijken van hartspiercellen van de cardiale cel-populatie. We bespreken het gebruik van verschillende enzym mixen voor cel-dissociatie, en hun effecten op cel-levensvatbaarheid. De geïsoleerde cardiomyocyten kunnen vervolgens worden gebruikt voor een verscheidenheid van morfologische, elektrofysiologische, biochemische, celbiologische en biomechanische testen. We geoptimaliseerd het protocol voor robuustheid en reproduceerbaarheid, door het gebruik van enige commercieel beschikbare oplossingen en enzym mengt die show weinig veel-te-veel variatie. We richten ook vaak problemen met de het kweken van hartspiercellen en bieden een verscheidenheid aan mogelijkheden voor het optimaliseren van isolatie en kweekomstandigheden.
De vroegste verslagen voor de succesvolle dissociatie en cultuur van knaagdieren hartcellen dateert uit de jaren 1960 1,2. Zelfs dan, Harary en Farley gemerkt dat gekweekte hartspiercellen "kan een uniek systeem voor de studie van de eisen van de periodieke contractiliteit bieden [en kan] een middel van het bepalen van de bijdrage van de verschillende metabole routes voor de [kloppende] proces". Hoewel Harary en Farley geïsoleerde en gekweekte hartspiercellen van jonge ratten, en het oorspronkelijke protocol is aangepast en gewijzigd door veel wetenschappers door de jaren heen, heeft de algemene isolatie en het kweken procedure niet sterk veranderd. Echter beter enzymen 3, standaardoplossingen 4,5, en de toevoeging van de omkeerbare kanaal en myosine ATPase inhibitor BDM cellen beschermen tijdens de isolatieprocedure 6-9 aanzienlijk verbeterde cel-opbrengst en levensvatbaarheid.
Volwassen vs neonatale cardiomyocyten
Hartspiercellen geïsoleerd en gekweekt uit pasgeboren muizen of ratten hebben een aantal voordelen ten opzichte van culturen van volwassen hartspiercellen. Plaats de isolatieprocedure voor neonatale muis of rat hearts is gemakkelijker en goedkoper in vergelijking met de isolatie van cardiomyocyten van volwassen muis of rat 10. Neonatale cardiomyocyten zijn veel minder gevoelig voor herintroductie in een calcium-bevattende medium na dissociatie, aanzienlijke verhoging van cel-opbrengst. Een ander groot voordeel is dat neonatale muis hartspiercellen ondergaan een snellere dedifferentiation – redifferentiatie cyclus die meestal resulteert in een spontaan verslaan cellen 20 uur na plating, terwijl volwassen hartspiercellen vergen doorgaans pacing om contractie te induceren. Neonatale cardiomyocyten zijn ook gemakkelijker transfecteerbare met liposomaal transfectiewerkwijzen, terwijl volwassen hartspiercellen vereisen virale vectoren voor succesvolle oplevering van transgeen DNA. In tegenstelling tot neonatale cardiomyocytens, de cultuur van volwassen knaagdieren hartspiercellen 11-13 zorgt voor onderzoeken van myofibrillair degradatie en uiteindelijk herstel van het contractiele apparaat. Deze karakteristieke morfologische veranderingen in volwassen hartspiercellen plaatsvinden over een periode van 1-2 weken. De dedifferentiatie – redifferentiatie gaat gepaard met reexpression van het foetale genprogramma, waardoor pathologische veranderingen waargenomen in menselijke cardiomyopathieën 14 nabootsen. Een ander voordeel van volwassen hartspiercellen ratten via kweek van neonatale cardiomyocyten is de mogelijkheid om kweek deze cellen voor langere tijd.
Rat vs muis hartspiercellen
De isolatie en de cultuur van de rat neonatale cardiomyocyten heeft een aantal voordelen ten opzichte van dat van de muis neonatale hartspiercellen, met inbegrip van hogere opbrengsten van levensvatbare cellen en verhoogde transfectie tarieven. De brede gebruik van genetisch gemodificeerde muismodellen voor hartaandoeningen (bijv. </ Em> de spier lim eiwit knockout muis als model voor uitgezette cardiomyopathie 15) heeft geleid tot de aanpassing van de isolatie procedure voor cardiomyocyten afgeleid van pasgeboren muizen. Hoewel de protocollen neonatale ratten en muizen cardiomyocyten isoleren bijna identiek moet zorgvuldiger worden genomen bij de keuze van een geschikt enzym mix voor de laatste. Inderdaad, neonatale muis hartspiercellen algemeen gevoeliger voor overdigestion, resulterend in een verminderde cel-opbrengst en levensvatbaarheid. Bovendien moet de beplating dichtheid aangepast, omdat cardiomyocyten afgeleid van neonatale muizen zijn iets kleiner dan cellen uit neonatale rat hearts.
Bij veel toepassingen voor het onderzoeken van morfologische, elektrofysiologische, biochemische, celbiologische en biomechanische parameters, alsmede voor het proces van myofibrillogenesis zijn gekweekte neonatale cardiomyocyten een van de meest veelzijdige systemen voor de studie van gewordencardiale celfuncties in vitro. De eerste stap naar een succesvolle test is echter afhankelijk van een gemakkelijke en betrouwbare methode voor neonatale muis hartspiercellen isoleren. Ons protocol haalt zijn methodologie uit vele bronnen en werd geoptimaliseerd voor reproduceerbaarheid en robuustheid. We bespreken factoren cardiomyocyt-opbrengst en levensvatbaarheid beïnvloeden, en bieden een verscheidenheid aan mogelijkheden voor het optimaliseren van isolatie en kweekomstandigheden.
Het gebruik van diermodellen om hartziekten te bestuderen is standaard geworden in het cardiovasculair onderzoek. Dichter biochemische karakterisering van deze modellen (dwz het bestuderen van directe reacties van hartcellen aan biochemische of biomechanische stimuli) vereist meestal de isolatie van hart weefsels of hartspiercellen. Onderzoeken naar fysiologische reacties van het hart ex vivo (bv. om acetylcholine 40, of in ischemie-reperfusie scenario 41) over het algemeen gebrui…
The authors have nothing to disclose.
Wij zijn dankbaar aan Prof emeritus Jean-Claude Perriard en Evelyn Perriard (Zwitserse Federale Instituut voor Technologie, Zwitserland) voor de introductie in isolatietechnieken voor neonatale rat en muis hartspiercellen. We willen graag Prof Ju Chen en prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) bedanken voor hun steun. Werk in het laboratorium van EE werd gefinancierd door een MRC Career Establishment Grant. SL wordt ondersteund door een K99/R00 pad naar onafhankelijkheid onderscheiding van de NIH / NHLBI (HL107744). TMM werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van de American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|