我们描述了一种用于跟踪内膜破裂引起的细胞内的细菌<em>痢疾杆菌<em></em</em>和<em<em><em>结核杆菌</em></em</em>侵入宿主细胞后。我们的检测利用CCF4,宿主细胞质FRET探针在活的或固定的细胞。记者降解的酶活性存在于细菌表面。
痢疾杆菌是致病菌侵入宿主细胞的进入内吞液泡的。随后,该膜封闭隔室的破裂使细菌胞质溶胶内移动,增殖和,进一步侵入相邻小区。 结核分枝杆菌的免疫细胞吞噬,最近已被证明在巨噬细胞的吞噬体膜破裂。我们开发出一个强大的痢疾杆菌或结核杆菌进入宿主细胞的吞噬体膜破坏后的跟踪检测。方法利用CCF4,荧光共振能量转移,在宿主细胞的胞质溶胶中达到平衡的β-内酰胺酶敏感的记者。入侵的细菌病原体的宿主细胞后,探头保持不变,只要细菌驻留在膜封闭车厢。后的表面上的细胞内病原体劈开CCF4瞬间中断的液泡,β-内酰胺酶的活性,导致ING FRET信号的损失和开关其发射光谱。这一功能强大的比例测定产生细菌的侵入引起的液泡破裂的定时的准确信息,并且它可以被耦合到由专门的算法,用于检测发射信号的自动显微镜和图像处理FRET的供体和受体。此外,它允许调查液泡中断引起的细胞内细菌在单细胞实时动态。最后,它是非常适合高通量分析与时空分辨率,超过以前的方法。在这里,我们提供了实验示范协议的细节CCF4对HeLa细胞和THP-1巨噬细胞的液泡破裂试验时间推移实验或终点实验中使用的痢疾杆菌以及多分枝杆菌菌株,如分枝杆菌 , 牛分枝杆菌,结核杆菌 。
在感染过程中,众多的细菌性病原体的真核细胞中的膜封闭的室内部。发生单元格输入或者通过专门的宿主细胞的吞噬作用,是用于结核分枝杆菌的情况下,被巨噬细胞摄取,或病原体积极诱导其典型的非吞噬细胞摄取到。病原体引起的吸收的情况下,例如福氏志贺菌 ,在其他细胞功能紧密地调控内膜造成细菌定位在核内体的隔室1,2之内的分选机械劫持到宿主胞质溶胶注入效应蛋白。随后, 志贺氏菌破坏封闭的膜导 致的空泡破裂和干扰主机的膜贩运和避免传递到溶酶体的病原体胞浆访问。最近,phagolysosomal破裂也被发现感染STRategy用于由结核杆菌 ,膜结合隔间3,17只局限在很长一段时间被认为病原体。
调查病原体侵入细胞内的膜贩运动态,已经取得了很大的改进,由于透射电子显微镜(TEM)的基础研究20世纪80年代后期4,5。例如,使用染料的荧光显微镜方法,对细菌表面成分,或与亚细胞定位标记的抗体接手6,7。然而,他们仍然没有得到精确的时空分辨率和鲁棒性由细菌病原体定量测量空泡破裂。
这一障碍已经解决与试验的基础上派生头孢CCF4-AM FRET记者,最初是用来研究基因表达8。然后,将其INF的上下文中使用调查挠度生物学效应的分泌,并按照奈瑟菌吸收到宿主细胞9,10,11。我们开发了一个检测研究空泡破裂引起的痢疾杆菌和结核杆菌 17本报记者趁着。我们的方法的原理是利用图1中描述痢疾杆菌 。首先,宿主细胞被加载与FRET CCF4-AM,被困住的细胞质内裂解后的AM酯部分的基板。然后,细胞与痢疾杆菌感染。的表面上存在的β-内酰胺酶的细菌是能够裂解尽快液泡破裂时,CCF4基板。这将导致切换从535 nm至450nm的发射峰在405nm处激发时探头的FRET信号的损失。 450/535 nm的强度的比例测量突出空泡完整性:低比率反映膜而高比例反映的封闭或胞菌的细菌和宿主细胞质之间的接触。我们也适应这种方法的研究由结核分枝杆菌引起的THP-1巨噬细胞的吞噬体破裂。该实验的原理是相同的,但顺序相反,只适用于细菌感染后CCF4-AM加载。
因此,在单细胞水平上通过的比例荧光定量测量, 痢疾杆菌空泡破裂可以实时跟踪和固定样本从不同类型的细胞12,13,14。此外,这种方法可适应所示,在本研究中使用牛分枝杆菌和结核分枝杆菌的一些其他病原体侵入。最后,我们的协议(96孔或384孔)格式的小型化,可在高吞吐量的许多条件的筛选。
的CCF4-AM/β-lactamase检测是一个简单的方法来跟踪诱导细胞内痢疾杆菌和分枝杆菌在不同类型的细胞的液泡中断。它利用一内酰胺酶敏感的细胞质FRET记者活跃的表面上的细菌的酶裂解。
CCF4-AM基板的亏损是很容易避免加入丙磺舒所有的解决方案后,装载的基板。正如所演示的那样,该法可以适应多种类型的细胞(上皮细胞,吞噬细胞)和格式(96孔,35毫米的玻璃底菜,6/12/24孔板)。对于6/12/24孔板的使用,,无菌盖玻片分布在播种前的细胞的各孔的底部。在实验结束时,在载玻片上转移盖玻片安装介质,如延长黄金抗淬灭试剂(Invitrogen公司)。通过这种方式,信号是稳定的较长的时间周期后,测定相比,固定后的样品保存于PBS中的96孔格式。的CCF4-AM基板的成本高,应考虑之前确定的样本量。这就是为什么我们建议缩放下来。实验6/12/24以及格式更昂贵,但信号是稳定的天。与此相反,实验是在96孔格式的便宜,但在实验当天,将要分析的样品。值得注意的是,在96孔或384孔的格式也可以进行现场实验可以。这使得在同一时间(突变的细菌,内政部,质粒或转染,化学物质等)的使用条件下的几十个数字每口井的位置,进行现场实验。虽然适用于痢疾杆菌 ,我们强调的是“真正的”实时或延时实验分枝杆菌的研究是不可行的,因为感染周期超过CCF4可测量的浓度可保留在细胞质。为这个原因,CCF4-AM的细胞基板上涂敷后,才实现入侵。
MetaMorph软件用于采集和分析,我们建议使用该模块“屏幕收购”,允许获得一个完整的96/384孔板指定数目的每口井的照片。此外,该模块的“审查屏幕数据”允许(一)可视缝合每个图片马赛克以及任何通道的同时上了一个大的“大字报”及(ii)循环测量强度在535和一个专门的算法450纳米通道。虽然,我们已经由单一的细菌,使用时间推移显微镜能够测量空泡破裂,我们想提醒说,表面上单个细菌酶的活性变化使其难以精确关联胞内细菌的数量和有效性空泡破裂。
由于检测的鲁棒性,它是适合的hIGH吞吐量接近96或384孔的格式。我们还成功地适应这个协议流式细胞仪分析研究感染的细胞悬浮液中16。该试剂盒也可以用于为调查其他细菌或载体,在其表面上呈现内酰胺酶,导致广泛的应用。例如,这种方法可以用来研究空泡破裂引起的其他病原体,如β-内酰胺酶的表达嗜肺军团菌 , 李斯特菌或鼠伤寒沙门氏菌 12。由于单核细胞增生李斯特氏菌具有与痢疾杆菌的感染周期短,时间推移实验是可能的。相比之下,因为嗜肺军团菌和鼠伤寒沙门氏菌显示感染周期长,我们建议进行终点实验。
的各种可能的应用使得CCF4-AM/β-lactamase的测定有趣的荧光法用于跟踪固定样品或实时细胞内的病原体引起的空泡破裂。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由国家法新社倒拉RECHERCHE由欧洲研究理事会。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |