Summary

Isolamento e analisi di Brain-sequestrati da leucociti<em> Plasmodium berghei</em> ANKA topi infettati

Published: January 02, 2013
doi:

Summary

Un metodo per l'isolamento di aderenti leucociti infiammatori dai vasi sanguigni cerebrali dei<em> Plasmodium berghei</em> ANKA topi infettati è descritto. Il metodo consente la quantificazione e caratterizzazione fenotipica di leucociti isolati dopo colorazione con anticorpi fluorescenti e successiva analisi mediante citometria a flusso.

Abstract

Si descrive un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule infiammatorie aderenti da vasi sanguigni cerebrali di P. berghei ANKA topi infettati. L'infezione di ceppi sensibili del mouse con questo risultati di deformazione parassita nella induzione di sperimentale malaria cerebrale, una sindrome neurologica che riassume alcuni aspetti importanti del Plasmodium falciparum mediata da malaria grave in 1,2 esseri umani. Forme mature di sangue stadi malaria esprimere proteine ​​parassite sulla superficie del eritrociti infetti, che consente loro di legarsi a cellule endoteliali vascolari. Questo processo induce ostruzioni del flusso sanguigno, causando ipossia e 3 emorragie e stimola anche il reclutamento di leucociti infiammatori al sito di sequestro parassita.

A differenza di altre infezioni, ad esempio virus neutrotopic 4-6, sia la malaria-parassitati globuli rossi (PRBC), così come associati inflammleucociti stre rimangono sequestrati all'interno dei vasi sanguigni e non infiltrante il parenchima cerebrale. Perciò, per evitare la contaminazione di leucociti sequestrati con cellule circolanti non-infiammatorie, ampia perfusione intracardial di topi infetti-prima dell'estrazione di organi e lavorazione dei tessuti è necessario in questa procedura per rimuovere il comparto sangue. Dopo la perfusione, i cervelli vengono raccolte e sezionati in piccoli pezzi. La struttura del tessuto è ulteriormente disturbato da trattamento enzimatico con collagenasi D e DNAsi I. L'omogenato cerebrale risultante viene poi centrifugato su un gradiente di Percoll che permette la separazione dei cervelli sequestrati leucociti (BSL) mielina e detriti da altri tessuti. Cellule isolate vengono quindi lavate, contati utilizzando un emocitometro e colorate con anticorpi fluorescenti per la successiva analisi mediante citometria a flusso.

Questa procedura consente una completa caratterizzazione fenotipica dei leucociti infiammatori migrazione al cervello in response a vari stimoli, compreso il colpo così come le infezioni virali o parassitarie. Il metodo prevede anche un utile strumento per la valutazione di nuovi trattamenti antinfiammatori in pre-clinici modelli animali.

Protocol

1. L'infezione di topi con P. berghei-ANKA Sbrinamento un'aliquota di crioconservati P. berghei ANKA PRBC. Trattenere una malaria cerebrale resistente topo BALB / c donatore (8-12 settimane di età) con la tecnica a due mani di ritenuta. Iniettare il mouse con 100-200 ml di PRBC utilizzando un insulina siringa da 1 ml (28G ago). Di routine, 1-2 topi donatori vengono iniettati. In 4-5 giorni post-infezione (pi) rimuovere topo donatore da gabbia e collocarla su una …

Representative Results

I risultati in Fig. 2 percentuali di spettacoli e di numeri assoluti delle diverse popolazioni BSL recuperati da cervelli di perfusi o unperfused topi di controllo della malaria-infettati e ingenuo. Isolato BSL sono state colorate con PE-anti-NK1.1 e APC-anti-TCR β-anticorpi, come indicato nel testo del protocollo. In linea con i risultati precedenti 7-9, αβTCR + cellule T comprende una percentuale elevata della piscina BSL nel cervello di perfusi malaria topi infettati (giorno 6 pi). Questa pop…

Discussion

L'isolamento e l'analisi di BSL è un metodo che permette la caratterizzazione e la quantificazione delle cellule infiammatorie migrazione al cervello in risposta al danno tissutale o infezione in modelli murini sperimentali. L'introduzione di una fase di perfusione intracardial per la rimozione del comparto sangue prima dell'estrazione organi e isolamento cellulare successiva è utile per prevenire la contaminazione di cellule infiammatorie con leucociti circolanti non-infiammatorie. Questo potrebbe non…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare la signorina Liana Mackiewicz per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato reso possibile grazie vittoriana sostegno governativo Infrastrutture Stato operativo e del governo australiano National Health and Medical Research Council IRIISS e Progetto di sovvenzione 1.031.212.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Solutions and buffers
Giemsa’s azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500 1:10 dilution in distilled water
RPMI medium Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue Sigma Aldrich T-8154 1:2 dilution
Collagenase D Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I Sigma Aldrich D4263-5VL From bovine pancreas
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% solution in PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl) AnalaR 10017
Red Cell Lysis Buffer 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1M, pH 7.2
Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 R&D Systems FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Equipment and material
SuperFrost microscope slide Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir Nalgene
Rubber tubing
23G needle BD PrecisionGlide 302008
Cell dissociation kit containing metal sieve Sigma Aldrich CD-1
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
Hemocytometer GmbH Neubauer 717810
Flow cytometry tubes BD Falcon 352008

References

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Cite This Article
Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J., Hansen, D. S. Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice. J. Vis. Exp. (71), e50112, doi:10.3791/50112 (2013).

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