Depletion der ribosomalen RNA für Mosquito Gut metagenomische RNA-seq
Summary
A ribosomalen RNA (rRNA) Depletion-Protokoll wurde entwickelt, um Boten-RNA (mRNA) für die RNA-seq der Darm der Mücke metatranscriptome bereichern. Probe spezifischen rRNA-Sonden, die verwendet werden, um über rRNA Subtraktion zu entfernen waren, wurden aus der Mücke und dessen Darm Mikroben erstellt. Leistung des Protokoll kann bei der Entfernung von etwa 90-99% von rRNA führen.
Abstract
Darm der Mücke nimmt dynamischen mikrobiellen Gemeinschaften in den verschiedenen Phasen des Insekts Lebenszyklus. Charakterisierung des genetischen Kapazität und Funktionalität des Darms Gemeinschaft wird einen Einblick in die Auswirkungen der Darmflora sorgen für mosquito life Züge. Metagenomische RNA-Seq ist ein wichtiges Werkzeug, um Transkriptomen aus verschiedenen Mikroben in einer mikrobiellen Gemeinschaft zu analysieren. Messenger RNA umfasst in der Regel nur 1-3% der Gesamt-RNA, während rRNA stellt ca. 90%. Es ist eine Herausforderung, Boten-RNA aus einer metagenomische mikrobiellen RNA-Probe zu bereichern, weil die meisten prokaryotischen mRNA-Spezies stabilen Poly (A) Schwanz fehlt. Dadurch wird verhindert, Oligo-d (T) vermittelten mRNA Isolation. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Probe abgeleitet rRNA Fängersonden an rRNA von einem metagenomische RNA-Probe zu entfernen beschäftigt. Um zu beginnen, sind beide Mücke und mikrobielle kleinen und großen Untereinheit rRNA-Fragmente aus einem metagenomische Community DNA-Probe verstärkt. Dann wird die Kommunischaft spezifischen biotinylierten Antisense ribosomalen RNA-Sonden werden in vitro mit T7-RNA-Polymerase synthetisiert. Die biotinylierten rRNA-Sonden an der Gesamt-RNA hybridisiert. Die Hybride werden durch Streptavidin-beschichteten Kügelchen eingefangen und entfernt aus der Gesamt-RNA. Diese Subtraktion-basiertes Protokoll effizient entfernt sowohl Mücke und mikrobielle rRNA aus der Gesamt-RNA Probe. Die mRNA angereicherte Probe ist ferner für die RNA-Amplifikation und RNA-Seq verarbeitet.
Introduction
Next-Generation-Sequencing-Technologie hat Metagenomik Studie, indem sie die taxonomische Zusammensetzung und die genetische Funktionalität eines mikrobiellen Assemblage beurteilen fortgeschritten. RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) 1 umgehen kann Kultur-basierten Methoden, um mikrobielle metatranscriptomes in verschiedenen Kontexten 2-5 untersuchen. Ein Haupthindernis für mikrobielle RNA-seq ist die Schwierigkeit bei der Anreicherung mRNA, da die mRNA-Spezies prokaryotischen nicht stabil polyadenyliert sind. Daher ist Oligo-d (T)-vermittelten messenger Bereicherung nicht anwendbar. Entfernung von reichlich rRNA ist ein alternativer Ansatz zur mRNA bereichern. Kommerzielle rRNA Depletion-Kits, wie Microexpress bakterielle mRNA Enrichment Kit (Ambion), RiboMinus Transkriptom Isolation Kit (Bakterien) (Life Technologies), und mRNA-ONLY Prokaryotische mRNA Isolation Kit (Epicentre), die bevorzugt abgebaut rRNA mit einer Exonuklease, sind verwendet worden, zum Entfernen rRNA 6-8. Jedoch sind die Fangsonden im Microexpressoder RiboMinus sind gut zum Entfernen von bekannten rRNA von typischen Gram-positive und Gram-negative Bakterien (siehe Herstellerangaben), aber weniger kompatibel mit rRNA von unbekannten Mikroben. Folglich kann die Entfernung weniger effizient für metagenomische Proben 8-10. Außerdem war die mRNA Wiedergabetreue bedenklich, wenn die Exonucleasebehandlung 11 aufgebracht wurde. Insgesamt war Subtraktion-basierte rRNA Verarmung weniger voreingenommen und effektiver mRNA Anreicherung in metagenomische Einstellungen 10-13.
Darm der Mücke nimmt eine dynamische mikrobiellen Gemeinschaft 14. Wir sind daran interessiert in der Charakterisierung der Funktion von Darm der Mücke microbiome durch RNA-Seq. In einer RNA-Probe aus den Moskito-guts isoliert sind beide Mücke und mikrobieller RNA vorhanden. Hier beschreiben wir eine modifizierte Protokoll Gemeinschaft spezifische rRNA-Sonden zur effizienten Abbau Mücke und mikrobielle rRNA durch subtraktive Hybridisierung. Die resultierende mRNAangereicherte Proben sind für RNA-Seq. Der gesamte Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine komplexe mikrobielle Gemeinschaft befindet sich in Darm der Mücke Ökosystems 14,16,17. Metatranscriptomic Sequenzierung (RNA-seq) können kontextabhängig funktionelle Informationen durch Abfragen des gesamten mikrobiellen Transkriptom 4,18 offenbaren. Technisch ist Oligo-d (T) vermittelten Anreicherung prokaryontischer mRNA nicht anwendbar auf das Fehlen von stabilen Poly (A) Schwanz der Boten. Alternativ wurde für mRNA-rRNA-Depletion Anreicherung verwendet worden. Hier haben wir eine Subt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH 1SC2GM092789-01A1 unterstützt und MS war ein Forschungsaufenthalt von NMSU Howard Hughes Medical Institution Undergraduate Research Programs. Das Video wurde inszeniert und von Amy Lanasa produziert und koordiniert von Dr. Philip Lewis mit der Creative Media Institut NMSU.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Meta-G-Nome DNA isolation kit | Epicentre | MGN0910 | Metagenomic DNA isolation |
| TriPure | Roche | 11667165001 | Mdetagenomic RNA isolation |
| MEGAscript T7 kit | Ambion | AM1334 | In vitro synthesis of RNA probes |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | RNase free working area |
| Biotin-16-UTP | Roche | 11388908910 | In vitro synthesis of RNA |
| Biotin-11-CTP | Roche | 4739205001 | In vitro synthesis of RNA |
| Streptavidin magnetic beads | NEB | S1420S | Capture of rRNA hybrids |
| Magnetic separation rack | NEB | S1506S | Capture of rRNA hybrids |
| RNeasy mini kit | QIAGEN | 74104 | Purification of subtracted RNA |
| RNase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | Removal DNA contamination |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies Inc. | 5067-1513 | Electropherogram of RNA |
| Equipment | |||
| Bio-Gen PRO200 Homogenizer | PRO Scientific | 01-01200 | Mosquito gut tissue homogenization |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | DNA & RNA quantitation | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies Inc. | G2940CA | Electropherogram of RNA |
References
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