Cellulaire levensvatbaarheid hangt af van een tijdige en efficiënte beheer van eiwit misfolding. Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren van de verschillende potentiële lot van een verkeerd gevouwen eiwitten: hervouwing, afbraak of opslag in insluitsels. We demonstreren het gebruik van een opvouwbare sensor, Ubc9<sup> Ts</sup>, Voor monitoring proteostasis en aggregatie kwaliteitscontrole in levende cellen met behulp van 4D microscopie.
Een van de belangrijkste taken van elke levende cel is het handhaven van de juiste vouwing van nieuw gesynthetiseerde eiwitten in het gezicht van de steeds veranderende milieu-omstandigheden en een intracellulaire omgeving die dicht opeengepakte, kleverig, en gevaarlijk voor eiwitstabiliteit 1. De mogelijkheid om dynamisch evenwicht eiwitproductie, vouwen en degradatie vraagt zeer gespecialiseerde kwaliteitscontrole machines, waarvan de absolute noodzaak is het best waargenomen wanneer het storingen. Ziektes zoals ALS, de ziekte van Alzheimer, Parkinson, en bepaalde vormen van Cystic Fibrosis hebben een directe link naar het vouwen van eiwitten kwaliteitscontrole componenten 2, en dus de toekomstige therapeutische ontwikkeling vraagt om een fundamenteel inzicht in de onderliggende processen. Onze experimentele uitdaging is om te begrijpen hoe cellen schade signalen te integreren en monteer de reacties die zijn afgestemd op uiteenlopende omstandigheden.
De voornaamste reden waarom eiwit misfolding is een existentiële threin de cel is de neiging van verkeerd gevouwen eiwitten te aggregeren, waardoor een globale verstoring van de druk en delicate intracellulaire vouwen milieu 1. De vouwen gezondheid, of "proteostasis," van de cellulaire proteoom wordt gehandhaafd, zelfs onder de dwang van veroudering, stress en oxidatieve schade, door de gecoördineerde actie van de verschillende mechanistische eenheden in een uitgebreid kwaliteitscontrolesysteem 3,4. Een gespecialiseerde machines van moleculaire chaperonnes kunnen niet-inheemse polypeptiden binden en het bevorderen van hun vouwen in de oorspronkelijke toestand 1, richten ze voor afbraak door het ubiquitine-proteasoom-systeem 5 of ze doorverwijzen naar beschermende aggregatie insluitsels 6-9.
In eukaryoten wordt de cytosolische aggregatie kwaliteitscontrole belasting verdeeld tussen twee compartimenten 8-10: de juxtanuclear kwaliteitscontrole compartiment (JUNQ) en het onoplosbare eiwit borg (IPOD) (Figuur 1 – model).Eiwitten die geübiquitineerde de eiwitvouwing kwaliteitscontrole machines worden geleverd aan de JUNQ, waar ze worden verwerkt voor afbraak door het proteasoom. Verkeerd gevouwen eiwitten die niet worden geübiquitineerde worden doorgeschakeld naar de IPOD, waar ze actief zijn samengevoegd in een beschermende compartiment.
Tot op dit punt, is de methodologische paradigma van live-cell fluorescentie microscopie grotendeels te labelen eiwitten en volgen hun locaties in de cel op specifieke tijdstippen en meestal in twee dimensies. Als nieuwe technologieën zijn begonnen met het verlenen onderzoekers ongekende toegang tot de submicron schaal in levende cellen, is de dynamische architectuur van het cytosol in zicht komen als een uitdagende nieuwe grens voor experimentele karakterisering. We een methode voor het snel monitoren van de 3D ruimtelijke verdelingen van meerdere fluorescent gemerkte eiwitten in de gist cytosol tijd. 3D Timelapse (4D imaging) is niet alleen een technische uitdaging; rathaar vergemakkelijkt ook een dramatische verandering van het begrippensysteem gebruikt om cellulaire structuur te analyseren.
We maken gebruik van een cytosolisch vouwen sensor eiwit in levende gist om verschillende lot voor verkeerd gevouwen eiwitten te visualiseren in cellulaire aggregatie kwaliteitscontrole, met behulp van snelle 4D fluorescerende beeldvorming. De temperatuur gevoelige mutant van het eiwit Ubc9 10-12 (Ubc9 ts) is zeer effectief zowel als sensor van cellulaire proteostasis en een fysiologisch model voor het volgen aggregatie kwaliteitscontrole. Zoals met de meeste ts eiwitten, Ubc9 ts is volledig gevouwen en functioneel tolerante temperaturen als gevolg van actieve cellulaire chaperones. Boven 30 ° C, of wanneer de cel misfolding stress, Ubc9 ts misfolds gericht en volgt het lot van een natief globulair eiwit dat verkeerd gevouwen door mutatie, hitte-denaturatie of oxidatieve schade. Door smelten aan GFP of andere fluoroforen, kan worden gevolgd in 3D vormt Stress Foci, of dirigeerd naar JUNQ of IPOD.
Onze intuïties biochemische processen ontlenen werkblad experimenten waarin een goed gemengde oplossing van reactanten en producten mag evenwicht te bereiken in een bekerglas. In een dergelijke omgeving kan de concentratie van een bepaalde chemische stof worden uitgedrukt als een getal, dat de verhouding van de molaire hoeveelheid moleculen op een macroscopisch volume. Veel van wat we weten over eiwitstructuur en functie ontleent aan met behulp van methoden die de klassieke, bulk reactie afbeelding weer te geven: western blots, centrifugeren, en spectrofotometrische metingen uit op uittreksels uit homogenaten van hele populaties van cellen uitgevoerd.
Aangezien de technologie die we gebruiken om op cellen zien onder vergroting verbetert door sprongen en grenzen, wordt het steeds duidelijker dat de omstandigheden waarin de meeste biochemische reacties plaatsvinden in vivo alleen de geringste gelijkenis met die van de klassieke werkblad scenario dragen. Niet alleen is het inwendige van de cella dicht opeengepakte omgeving, waarin crowding effecten wezenlijke aantasting van de activiteiten van de verschillende reactanten, het is ook precies het tegenovergestelde van goed gemengd. Dit verklaart de vaak afwijken van in vitro en in vivo efficiëntie van diverse complexe macromoleculaire reacties.
Nergens zijn intuïties die voortvloeien uit de klassieke in vitro biochemische experimenten meer geneigd te misleiden zoals in de vragen betrekking hebben op de in vivo vouwen, misvouwing, en aggregatie van eiwitten. Dat studies van de eiwitchemie in bulk reacties kunnen de afgifte van vouwen voor een bepaald eiwit als een eenvoudige ja of nee vraag te behandelen, moet elke poging om de dynamiek van hele bevolking van macromoleculen bijhouden in een levende cel gevoelig voor de gehele verdeling van mogelijke conformationele resultaten beschikbaar om een polypeptide keten, met name om het risico van misvouwing en aggregatie. Zo kunnen we onderzoeken een bulk cel lysate van een aggregatie eiwit door western blotting en bepalen dat het eiwit overwegend onoplosbaar en niet geübiquitineerde. Echter, in de levende cel een discrete subpopulatie van het eiwit, moeilijk te detecteren wanneer het gemiddelde over vele cellen, kan oplosbaar en geübiquitineerde in een bepaald compartiment waar de lokale concentratie van de soort is zeer hoog. Dit laatste geval kan meer belangrijke gevolgen voor de levensvatbaarheid van de cel dan de grotere bulk subpopulatie. Bovendien dat chaperones tonen een verscheidenheid van pleiotropische gedrag en functies in vitro wordt steeds duidelijker dat in de cel hun discrete functies ruimtelijk en temporeel beperkt.
In de opkomende paradigma voor het begrijpen biochemie, concentratie wordt een variabele in elk specifiek nano-omgeving in de cel en de moleculaire gebeurtenissen die ten grondslag liggen biologische processen worden onderzocht niet alleen tijd, maar ook in space. De 4D imaging hier gepresenteerde benadering is geschikt voor gevoelige modellering van eiwit misfolding in levende cellen, maar kan worden gebruikt om een aantal andere biologische processen te bestuderen en hoe ze worden gereguleerd ruimte, tijd, en na veranderingen in omgevingscondities. In dit document gebruiken we de Ubc9 ts vouwen sensor, die effectief toont de stappen en mogelijkheden om met het begin van eiwitaggregatie in de cytosol. Naast illustreren de celbiologie van aggregatie kwaliteitscontrole kan deze benadering als een krachtig hulpmiddel voor het ontcijferen het effect van specifieke storingen of genetische mutaties op proteostasis (bijvoorbeeld Ubc9 ts kan worden gebruikt om eiwitvouwing stress te meten in reactie op oxidatie de expressie van een toxische aggregaat of mutaties in de kwaliteitscontrole pathway).
4D beeldvorming is ook essentieel voor het nauwkeurig bepalen van eiwit lokalisatie of colokalisatie tussen twee verschillende eiwittens, en voor het opsporen van fenomenen die misschien van voorbijgaande aard zijn, maar belangrijk. Bijvoorbeeld, vooral in een kleine bolvormige organisme zoals gist, kan het lijken zo dat een structuur of aggregaat juxtanuclear lokalisatie heeft, terwijl 4D beeldverwerking kan blijken dat dit eenvoudig een artefact van de hoek van inspectie.
In het voorbeeld experiment we hier tonen we het gebruik van een model verkeerd gevouwen eiwit Ubc9 ts, aggregatie kwaliteitscontrole in tijd en ruimte in de cytosol volgen. Bij de permissieve temperatuur wordt Ubc9 ts gevouwen en verspreid in de kern en cytosol. Bij warmte-geïnduceerde misfolding, vormt het in eerste instantie snel verspreiden kleine aggregaat Stress Foci die worden verwerkt voor proteasomale degradatie. Wanneer het proteasoom gedeeltelijk geremd, worden deze omgezet in Stress Foci JUNQ en IPOD insluitsels in de loop van ongeveer 2 uur. Als ubiquitine-gemedieerde afbraak is niet beschikbaar als een kwaliteitscontrole optie, Ubc9 ts wordt onmiddellijk omgeleid naar de IPOD opnemen voor beschermende aggregatie. Deze tools bieden ongelooflijke mogelijkheden om nieuwe genetische factoren betrokken bij de aggregatie kwaliteitscontrole te ontdekken, en om hun ruimtelijke en temporele regelgeving in de cel te verkennen.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
MG132 | Mercury | mbs474790 | |
con A | Sigma | C2010 | |
Glass bottom plates | ibidi | ibd81158 | |
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software. |