Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Summary

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Abstract

Doenças renais envolvendo perda urinária de grandes macromoléculas essenciais, tais como albumina do soro, têm sido desde há muito se pensa ser causada por alterações na permeabilidade da barreira composta de podócitos, as células endoteliais vasculares, e uma membrana basal trabalhando em uníssono. Dados do nosso laboratório usando microscopia intravital dois fótons revelou uma barreira mais permeável de filtração glomerular (GFB) do que se pensava em condições fisiológicas, com a recuperação de albumina filtrada ocorrendo em um subconjunto inicial de células chamadas células do túbulo proximal (PTC) ^{1,2 3.}

As técnicas anteriores usados ​​para estudar a filtração renal e estabelecer a característica da barreira de filtração envolvido micropunção do lúmen desses segmentos tubulares de amostragem mais cedo com o conteúdo ea análise do fluido ^4. Estes estudos determinaram a concentração de albumina no fluido luminal ser virtualmente inexistente; correspondente estreitamentecom o que é normalmente detectado na urina. No entanto, a caracterização de polímeros de dextrano com tamanhos definidos por esta técnica revelou aqueles com uma dimensão semelhante à albumina do soro tinham níveis mais elevados no lúmen tubular e de urina, o que sugere uma maior permeabilidade ^5.

Aqui é uma descrição pormenorizada da técnica utilizada para visualizar diretamente e quantificar glomerular fluorescente permeabilidade albumina in vivo. Este método permite a detecção da albumina filtrada através da barreira de filtração para o espaço de Bowman (a câmara de filtração inicial urinária) e também permite a quantificação de albumina reabsorção pelo túbulo proximal e visualização subsequente de transcitose albumina ^6. A ausência de albumina fluorescente ao longo dos segmentos tubulares posteriores rota para a bexiga realça a eficácia da via de recuperação nos segmentos tubulares proximais anterior. Além disso, quando esta técnica foi aplicada para determinar a permeabilidadedos foram relatados dextranos possuindo um tamanho semelhante aos valores de permeabilidade virtualmente idênticos albumina ^2. Estas observações suportam diretamente a necessidade de ampliar o foco de muitas doenças renais proteinúricas para incluídos alterações na recuperação de células do túbulo proximal.

Protocol

1. Conjugação de albumina de soro de rato Sulfo-rodamina 101 sulfonilo (vermelho do Texas) Dissolve-se 100 mg de albumina de soro de rato (RSA) em 6.667 ml de bicarbonato de sódio a 100 mM pH 9,0; concentração final de 15 mg / ml num tubo de 50 mL cónico. Solução lugar no gelo / água copo e legal entre 0 e 4 ° C. Adicionar 200 mL de dimetil formamida anidra qualidade elevada (DMF) a um frasco de 10 mg de cloreto de sulfonilo vermelho do Texas (TRSC); vórtice no meio durante 15 s…

Representative Results

A Figura 3 mostra um exemplo de uma imagem feita a partir de uma superfície de um glomérulo Munique Frömter rato Wistar e as medidas tomadas para determinar a permeabilidade da albumina fluorescente. O valor do SGC para a albumina derivada de 0,0111 para esta queda glomérulo individual no intervalo visto nesta linhagem de ratos Wistar de Munique, quando na condição alimentada 3. A estabilidade visto nestas imagens é devido à concepção e execução de instruções representadas nas <…

Discussion

Os passos destacados aqui representam o que sentimos ser aqueles que irão produzir valores de permeabilidade consistentes e precisas, porque eles contornar as seguintes armadilhas:

1. Dispersão: a utilização de um emissor de fluoróforos vermelhos permitem uma recolha mais eficiente da luz uma vez que mais fotões de comprimento de onda são menos propensas a dispersão. Usando tanto fluorophores emissores verdes ou azuis irá introduzir uma maior variação na GSC da causa do aumento da variabilidade nos …

Materials

Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07