我们描述了制备薄视网膜片从水产虎蝾螈(<em> Ambystoma tigrinum</em>),并解释我们如何使用这些切片研究获得双全细胞电压钳记录,从感光细胞和二阶的水平细胞和双极细胞在视网膜突触处理。
在视网膜神经科学的中心任务之一是了解视网膜神经细胞的电路,这些连接是如何塑造的信号传递给大脑负责。光子被检测到的视网膜杆和锥光感受器,它的能量转换成一个电信号,传送到其他的视网膜神经细胞,在那里进行处理和通信中心在大脑中的目标,通过视神经。重要的早期洞察视网膜电路和视觉处理来自卡哈尔1,2的组织学研究,后来,从电生理记录扣球视网膜神经节细胞的活性-输出的视网膜细胞3,4。
在视网膜中的可视处理的详细了解,需要了解的信令在视网膜神经节细胞的途径从感光体中的每个步骤。然而,许多视网膜细胞类型是牙钻IED在组织深处,因此相对人迹罕至的电生理记录。这种限制是可以克服工作与垂直切片,其中居住于视网膜层细胞清晰可见,电生理记录访问。
这里,我们描述了一种用于从仔鱼,:老虎蝾螈(tigrinum钝口螈属 )的垂直剖面的视网膜。虽然这最初是为准备录音用锋利的微电极5,6双全细胞电压钳记录,我们描述的方法,从感光细胞和二阶的水平细胞和双极细胞中,我们处理的感光膜电位,同时记录后在水平或双极细胞的突触反应。虎蝾螈的光感受器是远远大于那些哺乳动物物种,这是一个理想的制剂,其中承接吨他在技术上具有挑战性的实验方法。这些实验着眼探测突触带信号性能描述-一个专门的突触结构,发现在一个只有极少数的神经元,包括杆和视锥细胞,非常适合保持率很高的滋补神经递质的释放7 ,8 -和它有助于视网膜突触这首独特的信令性能。
视网膜切片准备已经被证明是非常有用的分析视网膜处理视觉信息的电路和机制。同时获得全细胞记录前和突触后神经元的能力一直在这一努力中特别有用。配对的全细胞记录片更容易实现比平面式视网膜制剂,因为不同的视网膜层暴露。此外,由于其大的视网膜神经细胞,蝾螈有悠久的历史,作为视网膜的准备,因此提供了一个特别良好的特点的模型系统。
通过实践,蝾螈视网膜的健康片可以定期编制。几个关键的步骤,可以使成功和失败之间的差异。 1)确保刀片安装的组织切片机上,以便它贴在玻璃表面和片平放在干净,但组织和underlyi毫微克的硝酸纤维素膜。通过硝酸纤维素膜,如果你已经做了一个干净的切割,你应该听到一声微弱的点击刀片罢工载玻片表面。 2)确保视网膜坚持到硝酸纤维素膜。否则,视网膜可以浮动相差的膜,在任何步骤中的程序。 3)不要切割片暴露在空气中,因为这将损害许多表层细胞。 4)确保片和硝酸纤维素膜对玻璃滑动平躺,使视网膜层解剖显微镜下是显而易见的。 5)平衡灌流流入和流出率为了避免溢出录音室。这可以防止在溶液水平的突然变化,这会导致突然的组织的活动。 6)选择健康的细胞对彼此接近。光滑胞浆细胞比健康细胞胞浆呈颗粒状。更深切片的细胞更可能保留完整的突触CON触点。 7)确保枪头不破或其他组织或碎片的道路上蹭着细胞。 8)检查,以确保它没有被阻塞碎片或泡沫,这两者都可以使它很难获得高质量的全细胞记录吸液管电阻。
,而不是视网膜附着到硝酸纤维素滤纸上,一些调查嵌入视网膜在一个块中的琼脂,并使用一个vibratome切割视网膜切片获得。虽然我们还没有试过这种方法,11 Kim 等人讨论这两种方法的优点。根据他们的经验,琼脂为基础的方法提供了更一致的平片产量与划定视网膜层,但滤纸为基础的方法产生健康的感光细胞。
杆和视锥细胞负责传导光线进入的膜电位变化。杆和视锥细胞的膜电位与配对录音,可以manipul直接生成,因此产生光的反应能力,同时有助于确定细胞类型,可能是必不可少的。因此,我们经常准备切片在白光。然而,即使在明亮的光照下准备,蝾螈视网膜神经细胞可以产生大量的光反应所示,由图中的响应。 3。这部分是由于到生色团外段大体积比较大的水库,但也可能反映Müller细胞的再生能力的11 -顺式视网膜视锥细胞12。要获得充分的暗适应光的反应,我们可以准备切片在红外线照射下。解剖红外光下,我们重视GenIII图像增强(Nitemate NAV3,利顿工业公司,亚利桑那州坦佩)解剖显微镜的目镜和一个红外LED手电筒照亮的组织。对于切片和其他程序都没有进行解剖显微镜下,我们聘请了头戴式IMAGE增强。安置的补丁移液器,切片使用红外敏感CCD相机(WATEC公司, 如 WATEC 502H米德尔敦,NY)安装到直立,固定阶段显微镜可视化。这些预防措施,可以得到单光子灵敏度6,13杆响应参展。
在视网膜切片工作的一个限制是长期大视野视网膜神经元细胞过程可能会失去他们的许多树突在切片过程。视网膜切片的准备,因此更有益的研究的生理的细胞的突触接触涉及靠近细胞体的过程。两栖类和哺乳动物的视网膜共享许多相同的细胞类型,并利用类似的生理机制14-16。蝾螈视网膜的良好模型的哺乳动物的视网膜中的许多方面的一个重要的区别似乎是一个专用杆通路的存在下在哺乳动物INVOlves专门杆双极细胞接触到AII无长突细胞14。蝾螈视网膜的另一个局限性是国内少数专门为这个物种的遗传工具。然而,抗体和shRNA试剂,目标以及在其它物种中保守的区域可以成功地用于在蝾螈,以及许多小分子抑制剂和肽试剂。此外,随着技术的一些修改,视网膜切片可以准备一些这些工具更容易获得来自其他物种。
除了配对的全细胞记录其效用,蝾螈视网膜切片准备也适合各种其他方法。正如上面所讨论,视网膜切片可用于研究与各种电压钳位协议17的组合的光反应。视网膜神经细胞也可以被载入敏感的荧光染料的Ca 2 +,Cl –的,或Na+引入通过的补丁吸管或15,18-20浴应用。束缚的突触带21上的荧光肽可以通过引入补丁吸管和用于成像的发带10,或荧光素共轭时,急性和选择性地损坏条带22。我们也使用与量子点结合的视网膜切片监测运动杆和锥突触终端23的单独的钙离子通道。因此,垂直视网膜切片是一种多用途的研究基础突触机制和独特的处理功能,在视觉信号传导通路的第一突触进行实验准备。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由研究资助,防盲和国家卫生部授予EY10542研究院。
Name of the reagent/material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tissue slicer | Stoelting | 51425 | |
Double edge razor blades | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
Nitrocellulose membranes | Millipore | AAWP02500 | Type AAWP 0.8 mm pore |
Borosilicate glass pipettes | World Precision Instruments | TW120F-4 | 1.2mm OD 0.95 mm ID |
Ag/AgCl pellet | Warner | E206 | |
MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 ga. Filling needle, 67 mm long |