Summary

Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

Published: May 02, 2013
doi:

Summary

Descriviamo un test diagnostico prezioso che potrebbe potenzialmente essere utilizzato per decidere il ritiro di immunosoppressione dopo trapianto senza elevato rischio di rigetto del trapianto. Il test utilizza i principi di ipersensibilità di tipo ritardato e fornisce una valutazione accurata del donatore risposte immunitarie effettrici e normativi specifici montati dai destinatari.

Abstract

Risposta di ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è un rapido in manifestazione in vivo della risposta immunitaria delle cellule T-dipendente ad un antigene estraneo (Ag), che il sistema immunitario ospite ha sperimentato nel recente passato. Reazioni DTH sono spesso divisi in una fase di sensibilizzazione, riferendosi all'esperienza iniziale antigene, e una fase sfida, che segue solitamente parecchi giorni dopo la sensibilizzazione. La mancanza di una risposta di ipersensibilità di tipo ritardato per un richiamo Ag dimostrato da test cutaneo è spesso considerato come una prova di anergia. Il dosaggio DTH tradizionale è stato usato efficacemente nel diagnosticare infezioni microbiche molti.

Nonostante la condivisione funzioni immunitarie simili come infiltrazione linfocitaria, edema e necrosi tissutale, il DTH diretto non è una tecnica diagnostica fattibile in pazienti trapiantati causa della possibilità di iniezione diretta conseguente sensibilizzazione ad antigeni donatori e perdita del trapianto. Per evitare questo problema, il ronziouno-a-mouse "trans-vivo" test DTH è stato sviluppato 1,2. Questo test è essenzialmente un trasferimento di test DTH, in cui il sangue cellule umane mononucleate periferiche (PBMC) e gli antigeni specifici sono stati iniettati per via sottocutanea nei padiglioni auricolari o zampa di un topo ingenua e DTH-come gonfiore viene misurata dopo 18-24 ore 3. La presentazione dell'antigene da cellule presentanti l'antigene umano come i macrofagi o DCS a cellule T nei tessuti altamente vascolare del mouse attiva la cascata infiammatoria e attrae le cellule immunitarie del mouse con conseguente risposte gonfiore. La risposta è antigene-specifici e richiede preventiva antigene sensibilizzazione. Una risposta DTH donatore-reattiva positiva nel test Tv-DTH riflette che il paziente trapiantato ha sviluppato una disposizione immunitaria pro-infiammatoria verso alloantigeni innesto.

La caratteristica più importante di questo saggio è che può anche essere utilizzato per rilevare le cellule T regolatorie, che causano la soppressione astanti. Soppressione di un astanteDTH risposta richiamo alla presenza di antigeni del donatore è caratteristica di trapianto di rene-accettati 2,4-14. Il monitoraggio dei pazienti trapiantati per alloreattività e regolazione con Tv-DTH può identificare un sottogruppo di pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla riduzione di immunosoppressione senza elevato rischio di rigetto o di deterioramento della funzione renale.

Un'area promettente è l'applicazione del saggio Tv-DTH nel monitoraggio di autoimmunità 15,16 e anche in immunologia tumorale 17.

Protocol

1. Preparazione di linfociti Prelevare il sangue in (acido citrato destrosio) tubi di ACD. Isolare PBMC da sangue periferico umano fresco utilizzando linfociti di separazione medio secondo metodi standard. Lavare le PBMC tre volte con PBS per rimuovere le piastrine contaminanti. Le piastrine sono risultati interferire con test DTH trans-vivo. Massima ammissibile di contaminazione delle piastrine di preparazione PBMC è ≤ 1×10 7 / iniezione. Se vi è una contaminazion…

Representative Results

1. Valutazione del trapianto di rene per la risposta antigene-specifica donatore utilizzando test Tv-DTH Per testare il donatore-reattiva immunità cellulare nel trapianto di rene abbiamo iniettato PBMC di questi pazienti con antigeni del donatore da soli o con un richiamo antigene tossoide tetanico (TT). Come i pozzetti di controllo positivo sono stati iniettati con sola TT. Osserviamo tre modelli principali di ipersensibilità di tipo ritardato nei pazienti trapiantati (Figura 1).</st…

Discussion

Il saggio DTH trans-vivo è un test diagnostico romanzo con un potenziale applicazione clinica nella valutazione risposte mediate da cellule nel trapianto, cancro e pazienti autoimmuni. E 'prezioso perché non solo è utile nel monitoraggio delle risposte effettrici richiamo T, ma anche in grado di rilevare le risposte T regolatorie. Un modo affidabile per rilevare regolamento DTH umano potrebbe predire la sicurezza di recesso dell'immunosoppressione in pazienti che sono candidati per studi clinici in monoterapi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrebbero riconoscere i contributi di AM VanBuskirk allo sviluppo della nostra comprensione della risposta DTH regolamentato nei destinatari del trapianto. Questo lavoro è stato supportato sovvenzioni NIH PO1AI084853 e R01AI066219-06, e dalla UE sponsorizzato uno studio.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
ACD tube for blood collection BD 02-684-26  
Lymphocyte Separation Medium Cellgro 25-072-CV  
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Cellgro 21-031-CM Without calcium & magnesium
ACK Lysis Buffer BioWhittaker 10-548E  
TT/DT or EBV Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.   TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSF Sigma-Aldrich 78830  
Eosine for cell count Sigma-Aldrich E-6003  
Alloantigen     Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-18  
10 ml pipettes and pipettor BD Falcon 13-675-20  
2 ml safe-lock tubes Costar 3213  
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips      
Hemocytometer Fisher 02-671-10  
Full size centrifuge and microfuge Beckman Coulter/Eppendorf    
1/2cc or 1cc insulin syringes Becton Dickinson 14-826-79 28 gauge
Vibracell sonicator Divtech Equipment Co. Sonocs& Materials Inc   2 mm probe
Dial thickness gauge Mitutoyo, Japan    
SCID mice Harlan    
Isoflurane Piramal Healthcare   Inhalant anesthesia

References

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Cite This Article
Jankowska-Gan, E., Hegde, S., Burlingham, W. J. Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation. J. Vis. Exp. (75), e4454, doi:10.3791/4454 (2013).

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