Summary

Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Published: October 14, 2012
doi:

Summary

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Abstract

Neurone propria interazione glia è fondamentale per funzione fisiologica del sistema nervoso centrale (CNS). La comunicazione bidirezionale è sofisticato mediata da specifiche vie di segnalazione tra neuroni e glia 1,2. Identificazione e caratterizzazione di queste vie di segnalazione è essenziale per la comprensione di come l'interazione neurone a glia forme CNS fisiologia. In precedenza, le colture di neuroni e glia misti sono stati ampiamente utilizzati per il test e la caratterizzazione di vie di segnalazione tra neuroni e glia. Quello che abbiamo imparato da questi preparativi e altri strumenti in vivo, tuttavia, ha suggerito che la segnalazione reciproci tra neuroni e glia sono presentati spesso in settori specifici all'interno dei neuroni (cioè, assoni, dendriti, o soma) 3. Per questo è importante per sviluppare un nuovo sistema di cultura che permette la separazione dei compartimenti neuronali ed esamina in particolare l'interazione tra glia e neuronali assoni / dendriti. Inoltre, il sistema convenzionale coltura mista non è in grado di differenziare i fattori solubili e segnali in membrana di contatto tra neuroni e glia. Inoltre, la grande quantità di neuroni e cellule gliali del convenzionale sistema di co-coltura manca la risoluzione necessaria per osservare l'interazione tra un singolo assone e cellule gliali.

In questo studio, si descrive un assone romanzo e glia sistema di co-coltura con l'uso di una piattaforma microfluidica cultura (MCP). In questo sistema di co-coltura, neuroni e cellule gliali sono coltivati ​​in due camere separate che sono collegati attraverso molteplici canali centrali. In questa piattaforma microfluidica cultura, solo i processi neuronali (soprattutto assoni) può entrare nel lato gliali attraverso i canali centrali. In combinazione con potente etichettatura proteina fluorescente, questo sistema permette esame diretto di percorsi di segnalazione tra interazioni assonali / dendritiche e gliali, tales assone-mediata regolazione trascrizionale nelle cellule gliali, glia-mediata traffico recettore in terminali neuronali e glia-mediata della crescita degli assoni. Il diametro ridotto della camera vieta anche significativamente il flusso del neurone arricchito medio nella camera gliale, facilitando sondaggio della diretta membrana-proteina tra assoni / dendriti e superfici gliali.

Protocol

1. Assemblea della Camera Cultura Microfluidic (MCP) MCP (Figura 1) sono progettati per cavità si aprono culture compartimenti di diversi tipi di cellule 4. Ha tipicamente due compartimenti che sono collegati attraverso i canali centrale (3 mm di diametro). Montaggio di MCP con fondo di vetro piatti è necessario per la preparazione di culture e l'analisi di immagini successive. Primo, cappotto sterili fondo di vetro piatti con Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml…

Representative Results

Time-lapse imaging di analisi assone indotta da attivazione del promotore GLT1 negli astrociti Il neurone compartimenti e astrociti co-coltura sistema consente solo i processi neuronali, in particolare gli assoni, di interagire selettivamente con astrociti. Seguendo la costituzione ottimale di assoni e astrociti (o altre cellule gliali) co-coltura in assemblata MCP, diversi tipi di assone-glia interazioni possono essere studiate come; assone indotta attivazione di attivazione astrogliale gene p…

Discussion

Il neurone MCP based e astrociti co-coltura sistema consente di dissezione neurone dettagliata astroglia vie di segnalazione permettendo solo gli assoni passare i canali centrali e interagire con le cellule astrogliali. Questo co-coltura sistema può essere comodamente impostato con neurone convenzionale e procedure di coltura astrociti. Abbiamo anche descritto un applicazione pratica di questo sistema di co-coltura con l'impiego di un reporter eGFP based per dimostrare assone-dipendente attivazione promotore GLT1 n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il Dott. Jeffrey Rothstein per la fornitura di BAC GLT1 topi eGFP e GLT1 anticorpi; Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) per la fornitura di servizi di base preziosi, New facoltà di assunzione di assegnazione (NIH 5P30NS069254 P30-02 , PI, Phil Haydon) in Tufts Neuroscienze Dipartimento.

Materials

Fetal bovine serum Hyclone SH30070.03 for plating neuron for neuron cutlure medium
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F4135 for astrocyte culture medium
Glial derived nerve factor R&D systems 212-GD Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber
Dulbecco modified eagle medium high glucose Sigma-Aldrich 11995  
70 mm cell strainer BD Falcon 352350  
Sterile glass bottom dish MatTek Corporation    
Microfluidic culture platforms Xona Microfluidics LLC SND150  
6 wells of the culture plate Cellstar 657 160  
     

Neuron culture medium

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
     

Neuron culture medium for plating cell

  • Neurobasal medium
  • 2% B27 Neurobasal supplement
  • 2 mM glutamate by adding 1% 100x GlutaMAX
  • 1% Penicillin-streptomysin
  • 5% Fetal bovine serum SH30070.03
     

Astrocyte culture medium

  • Dulbecco modified eagle medium high glucose
  • 10% Fetal bovine serum F4135
  • 1% Penicillin-streptomysin
     

Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system.

References

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Cite This Article
Higashimori, H., Yang, Y. Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System. J. Vis. Exp. (68), e4448, doi:10.3791/4448 (2012).

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