Описывается два шага маркировки процесса с использованием β-glucosyltransferase (β-GT), чтобы передать азид-глюкозы до 5-HMC, а затем нажмите химия для передачи биотин компоновщика для легкой и плотности независимых обогащения. Это эффективный и конкретный маркировки метод позволяет обогащению 5-HMC с крайне низким фоном и высокой пропускной эпигеномном отображения с помощью следующего поколения секвенирования.
5-метилцитозин (5-MC) составляет ~ 2-8% от общего цитозина в геномной ДНК человека и влияет на широкий спектр биологических функций, включая экспрессию генов, поддержание целостности генома, родительского импринтинга, инактивации Х-хромосомы, регуляция развития, старения и рака 1. В последнее время в присутствии окисленного 5-тС, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), был обнаружен в клетках млекопитающих, в частности, в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и нервных клеток 2-4. 5-HMC образуется при окислении 5-тС катализируемой ТЕТ семьи железа (II) / α-КГ-зависимых диоксигеназ 2, 3. 5-HMC предлагается принять участие в поддержании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) клетки, нормального кроветворения и злокачественных новообразований, а также развития зиготы 2, 5-10. Чтобы лучше понять функции 5-HMC, надежный и простой последовательности системы имеет важное значение. Традиционная последовательность бисульфита не могут отличить 5-HMC из 5-тС 11 </sup>. Чтобы распутать биологии 5-HMC, мы разработали высокоэффективные и селективные химические подход к маркировке и захват 5-HMC, пользуясь бактериофага фермент, который добавляет глюкозу группы к 5-HMC конкретно 12.
Здесь мы опишем простой двухэтапной процедуры для селективного маркировки химической 5-HMC. На первом этапе маркировки, 5-HMC в геномной ДНК помечена с 6-азид-глюкозы, катализируемой β-GT, glucosyltransferase из бактериофага Т4, таким образом, что переводит 6-азид-глюкозы до 5-HMC из Изменения кофактора, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). На втором этапе, биотинилирование, линкер дисульфида биотин прикреплен к азид группу, нажав на кнопку химии. Оба шага весьма конкретные и эффективные, ведущие к полному маркировке независимо от обилия 5-HMC в геномных регионов и дает крайне низкий фон. После биотинилирования 5-HMC, 5-HMC-содержащих фрагменты ДНК затем выборочно захваченныеиспользованием стрептавидина бусы в плотности независимым образом. Полученный 5-HMC-обогащенного фрагменты ДНК могут быть использованы для последующего анализа, в том числе следующего поколения секвенирования.
Наш избирательный маркировки и захват протокол дает высокую чувствительность, применимы к любому источнику геномной ДНК с переменным / разнообразна 5-HMC содержания. Хотя основной целью этого протокола является его вниз по течению приложений (например,. Следующего поколения секвенирования, чтобы наметить 5-HMC распределение в геноме), она совместима с одной молекулой, в режиме реального времени SMRT (ДНК) последовательность, которая является способные доставлять одной базе резолюции последовательности 5-HMC.
5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) является недавно идентифицированных эпигенетической модификацией настоящего в значительных количествах в определенных типах клеток млекопитающих. Метод, представленный здесь для определения генома распределение 5-HMC. Мы используем бактериофага Т4 β-glucosyltransferase пере?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM071440 в CH и NS051630/MH076090/MH078972 к PJ).
Name | Company | Catalog # | Comment |
Reagents | |||
5M Sodium chloride (NaCl) | Promega | V4221 | |
0.5M pH8.0 Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Promega | V4231 | |
1M Trizma base (Tris) pH7.5 | Invitrogen | 15567-027) | |
HEPES 1M, pH7.4 | Invitrogen | 15630 | |
Magnesium chloride (MgCl2) 1M | Ambion | AM9530G | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337-100 | |
DBCO-S-S-PEG3-Biotin conjugate | Click Chemistry Tools | A112P3 | |
1,4-Dithiothreitol, ultrapure (DTT) Superpure | Invitrogen | 15508-013 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen | 28304 | |
Micro Bio-Spin 6 Column | Bio-Rad | 732-6222 | |
Dynabeads MyOne | Invitrogen | 650-01 | |
Streptavidin C1 | |||
Qiagen MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
UDP-6-N3-glucose | Active Motif | 55013 | |
Enzyme | |||
β-glucosyltransferase (β-GT) | New England Biolab | M0357 | |
Equipment | |||
Sonication device | Covaris | ||
Desktop centrifuge | |||
Water bath | Fisher Scientific | ||
Gel running apparatus | Bio-Rad | ||
NanoDrop1000 | Thermo Scientific | ||
Labquake Tube Shaker | Barnstead | ||
Labquake Tube Shaker | Thermolyne | ||
Magnetic Separation Stand | Promega | Z5342 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
Reagent setup 10 X β-GT Reaction Buffer (500 mM HEPES pH 7.9, 250 mM MgCl2) 2 X Binding and washing (B&W) buffer (10 mM Tris pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.02% Tween 20). |