O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.
Várias abordagens experimentais têm sido utilizados no mouse para induzir lesão muscular com o objetivo de estudar a regeneração muscular, incluindo injeções miotoxina (bupivacaína, cardiotoxina ou notexin), transplantes musculares (denervação desvascularização-regeneração induzida), exercício intensivo, mas também modelos murinos de distrofia muscular como o camundongo mdx (para uma revisão dessas abordagens ver 1). No peixe-zebra, abordagens genéticas incluem mutantes que exibem fenótipos de distrofia muscular (como runzel 2 ou sapje 3) e anti-sentido morpholinos oligonucleotídicas que bloqueiam a expressão de genes associados a distrofia 4. Além disso, as abordagens químicas também são possíveis, por exemplo, com a galantamina, um composto químico inibe a acetilcolinesterase, resultando assim em hipercontração, o que eventualmente leva a distrofia muscular 5. Abordagens entanto, genéticos e farmacológicos generally afectam todos os músculos no interior de um indivíduo, ao passo que a extensão dos ferimentos infligidos são fisicamente mais facilmente controlada espacialmente e temporalmente 1. Lesão física localizada permite a avaliação do músculo contralateral como controle interno. De facto, foi recentemente utilizado por laser de ablação celular mediada para estudar a regeneração do músculo esquelético no embrião do peixe-zebra 6, enquanto que um outro grupo recentemente relatada a utilização de um laser de dois fotões (822 nm) para danificar muito localmente na membrana plasmática de músculo de peixe zebra indivíduo embrionário células 7.
Aqui, relatamos um método para a utilização do laser Micropoint (Andor Technology) por lesão do músculo esquelético de células no embrião do peixe-zebra. O laser Micropoint é um laser de alta energia, que é adequado para a ablação de células alvo num comprimento de onda de 435 nm. O laser é ligado a um microscópio (na nossa configuração, um microscópio óptico Zeiss partir) de tal modo que o microscópio pode ser utilizado para o mesmo tempo fou focalizar a luz de laser sobre a amostra e para a visualização dos efeitos do ferimento (campo claro ou de fluorescência). Os parâmetros para controlar o comprimento de onda de pulsos de laser incluem, a intensidade e o número de pulsos.
Devido à sua transparência e desenvolvimento embrionário externo, o embrião do peixe-zebra é altamente favorável para ambos lesão induzida por laser e para estudar a recuperação posterior. Entre 1 e 2 dias após a fertilização, somíticos células do músculo esquelético progressivamente sofrerem maturação de anterior para posterior, devido à progressão da somitogénese do tronco para a cauda 8, 9. Nessas etapas, os embriões espontaneamente se contorcer e iniciar a natação. O peixe-zebra foi recentemente reconhecido como um importante organismo vertebrado modelo para o estudo da regeneração de tecidos, tal como vários tipos de tecidos (cardíaca, neuronal, vascular, etc) pode ser regenerado após a lesão no peixe-zebra adultos 10, 11.
Laser mediada lesão é um método poderoso para infligir feridas de um tamanho desejado, a ablação de células, a fim de estudar a regeneração em condições controladas, o embrião do peixe-zebra. Notavelmente, as células podem ser direcionados precisamente (Figura 2), e tanto a área de lesão, assim como de temporização pode ser controlada. Subsequentemente, o local da lesão e os processos de regeneração são facilmente monitorizados, registada (Figura 3) e analisadas <str…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Bob Nowak (Andor Technology) para obter ajuda e aconselhamento técnico. SA-S. é apoiado por uma bolsa de Heisenberg da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabalho foi financiado pelo DFG concessão SE2016/7-1.
Heating block | |||
Pair #5 forceps | Dumont | ||
Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
Petroleum jelly | |||
Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
Micropoint laser | Andor Technology | ||
Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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