<em> Drosophila</em> Сетчатка представляет собой кристалл типа решетки состоят из небольшого числа типов клеток, которые образуются в стереотипно<sup> 1</sup>. Его ответственность в сложный генетический анализ позволяет изучать сложные программы развития. Этот протокол описывает вскрытия и иммуногистохимии сетчатки на три отдельных стадий развития, с акцентом на фоторецептор дифференциации.
Соединение глаз дрозофилы состоит из около 750 омматидиев (блок глаз). Каждый ommatidium состоит из около 20 клеток, в том числе объектив-секретирующих клеток конуса, пигментные клетки, клетки щетины и восемь фоторецепторов (ОР) R1-R8 2. ОР имеют специализированные структуры микровиллярные, рабдомерами, которые содержат светочувствительные пигменты, родопсины (РИТ). Рабдомерами шесть ОР (R1-R6) образуют трапецию и содержат Rh1 3 4. Рабдомерами из R7 и R8 расположены в тандеме в центре трапеции и один и тот же путь света. R7 и R8 ОР стохастически выражают различные комбинации РИТ в двух основных подтипов 5: В подтипа 'P', Rh3 в р R7s сочетается с Rh5 в р R8s, в то время как подтип 'у', у Rh4 в R7s связано с В Rh6 у R8s 6 7 8.
Ранние спецификации ОР и развития омматидиев начинается в личиночной глаз усиков имагинальных дисков, монослой эпителиальных клеток. Волна дифференциация проводится над всей поверхностью диска 9 и инициирует собрание недифференцированных клеток в омматидиев 10-11. R8 'основатель ячейки указан первым и принимает на работу R1-6, а затем R7 12-14. Впоследствии, во время развития куколки, PR дифференциация приводит к обширным морфологические изменения 15, в том числе рабдомера образования, синаптогенез и в конечном итоге относительная влажность выражение.
В этом протоколе описываются методы вскрытия сетчатки и иммуногистохимии на трех определенные периоды развития сетчатки, которые могут быть применены для решения различных вопросов, касающихся сетчатки формирования и пути развития. Здесь мы используем эти методы для визуализации ступенчатой дифференциации PR в одной клеточном уровне в целом крепление личиночной, midpupal и взрослых сетчатки ( <sЧонг> рис. 1).
1. Поиск и устранение неисправностей
По нашему опыту, требующие вскрытия практике (до нескольких недель) и способствует достижению удобное положение рук 21, отдыхая локтями и предплечьями на стол и с помощью пальцев контакта с рассечение блюдо. Таким образом, только п…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана общение Эрман к HY. Х., Джейн Гроб Дети Мемориальный фонд медицинских исследований докторской стипендии для RJJ, NIH Грант F32EY016309 Д. В., Диссертация стипендий Нью-Йоркского университета Дина DJ, NIH GrantR01 EY13010 на компакт-диски и DFG стипендии для JR (RI 2208/1- 1). Мы благодарим Нины Фогт и Памела Boodram замечания по рукописи.
Reagent | |||
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
Equipment | |||
Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
Clear nail polish or Scotch tape | |||
Orbital shaker | Bellco | ||
Slide holder box | Fisher Scientific | ||
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Thin paintbrush | |||
P20 and P200 micropipettes and tips | |||
Dissecting microscope | |||
Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |