טכניקת הדמיה למעקב אחר שינויים אפשריים בממברנה עם רזולוצית המשנה מיקרומטר מרחבית ותת זמנית האלפית השנייה מתוארת. הטכניקה, המבוססת על ליזר עירור של צבעי מתח רגישים, מאפשרת מדידות של אותות באקסונים וטחונות האקסון, סניפי מסוף דנדריטיים, וקוצים הדנדריטים בודדים.
הבנת מאפייני biophysical והארגון תפקודי של תאי עצב בודדים וכיצד הם מעבדים מידע הוא יסוד להבנה כיצד המוח עובד. תפקידו העיקרי של כל תא עצב הוא לעבד אותות חשמליים, בדרך כלל ממקורות מרובים. תכונות חשמליות של תהליכים עצביים הן מורכבות מאוד, דינמיות, ובמקרה הכללי, אי אפשר לחזות בהעדר מדידות מפורטות. כדי להשיג מדידה אחת כזו היית, באופן אידיאלי, רוצה להיות מסוגל לפקח, במספר רבים של אתרים, אירועי subthreshold כשהם נוסעים מאתרים של מקור בתהליכים עצביים וsummate במקומות מסוימים כדי להשפיע על ייזום פוטנציאל פעולה. מטרה זו לא הושגה בכל תא עצב בשל מגבלות טכניות של מדידות שמעסיקות אלקטרודות. כדי להתגבר על חסרון זה, רצוי מאוד כדי להשלים את גישת תיקון-אלקטרודה עם שיטות הדמיה המאפשרות recordin המקביל הנרחבGS מכל חלקי תא עצב. כאן, אנו מתארים טכניקה כזו – הקלטה אופטית של הארעיים פוטנציאליים קרום עם צבעים אורגניים מתח רגישים (V-m הדמיה) – מאופיינים בתת האלפית השני ורזולוצית המשנה מיקרומטר. השיטה שלנו מבוססת על עבודתו החלוצית בבדיקות מתח רגישות מולקולריות 2. היבטים רבים של הטכנולוגיה הראשונית שופרו ברציפות במשך כמה עשורים 3, 5, 11. בנוסף, עבודה קודמת תעדה שני מאפיינים מהותיים של V-מ 'הדמיה. ראשית, אותות קרינה הם ליניארי יחסיים לפוטנציאל קרום מעל הטווח הפיזיולוגי כל (-100 mV ל100 mV; 10, 14, 16). שנית, הנוירונים טעינה עם לצבוע מתח הרגיש משמש כאן (JPW 3028) אין לו השפעות תרופתיות לזיהוי. נרשמה רחבה של ספייק במהלך טעינת צבע היא הפיכה לגמרי 4, 7. בנוסף, עדות ניסויית מראה כי ניתן להשיגמספר משמעותי (עד מאה) של הקלטות לפני כל השפעות גילוי phototoxic 4, 6, 12, 13. כרגע, אנחנו מנצלים את הבהירות והיציבות המעולות של מקור אור ליזר באורך גל קרוב לאופטימלי למקסם את הרגישות של טכניקת V-מ 'ההדמיה. הרגישות הנוכחית מאפשרת הקלטות אופטיות אתרים מרובות של הארעיים V מ 'מכל חלקי הנוירון, כולל אקסונים וטחונות האקסון, סניפים הדנדריטים מסופים, וקוצים הדנדריטים בודדים. המידע שנרכש על אינטראקציות אותות ניתן לנתח כמותית כמו גם ישירות דמיין בצורה של סרט.
מאמר זה מתאר שיטת הקלטה לצבוע מתח רגישה לניטור פעילות חשמלית של תאי עצב בודד ב- מיקרומטר משנה ורזולוצית המשנה האלפית השנייה חלל ובזמן. עירור ליזר באורך גל קרוב לאופטימלי (לגבי גודל אות) שפר את הרגישות של הקלטה בפקטור של ~ 50 על גישות קודמות. הרגישות הנוכחית מאפשרת ניטור …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למשתפי הפעולה שלנו הקנוט Holthoff, ארתור Konnerth ומרק Canepari שהשתתף בפיתוח הראשוני של טכניקה זו, כמו גם לסלי מ 'לייב למתן צבעים חביבים. נתמך על ידי מענק NSF IOS-0817969, מענקי NIH NS068407 וM136043 ועל ידי מכון קאוולי למדעי המוח באוניברסיטת ייל.
Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Setup components | |||
Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
Specific reagents | |||
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |