Этот протокол описывает метод визуализации ДНК двухцепочечной перерыв сигнальный белок активируется в ответ на повреждения ДНК, а также его локализации во время митоза.
Двунитевых разрывов (ДР) являются наиболее вредными повреждения ДНК клетки может столкнуться. Если оставить неустраненные, DSBs гавани большой потенциал для создания мутаций и хромосомных аберраций 1. Чтобы предотвратить эту травму от катализирующих геномной нестабильности, крайне важно для клеток для обнаружения DSBs, активировать ответ повреждение ДНК (РДР), и ремонт ДНК. Когда стимулируются, DDR работает, чтобы сохранить целостность генома, вызывая остановку клеточного цикла, чтобы обеспечить ремонт пройдет или заставить клетки к апоптозу. Преобладающий механизм ремонта DSB происходить через негомологичных конце-присоединение (NHEJ) и гомологичной рекомбинации ремонт (HRR) (отзывы в 2). Есть много белков, чья деятельность должна быть четко организованы для DDR функционировать должным образом. Здесь мы опишем метод для 2 – и 3-мерные (D) визуализация одного из этих белков, 53BP1.
P53-связывающий белок 1 (53BP1) локализуется в областиDSBs путем связывания изменение гистонов 3,4, образуя очаги в течение 5-15 минут 5. Модификации гистонов и вербовки 53BP1 и других белков DDR для DSB сайтов, как полагают, содействие структурной перестройке хроматина вокруг области повреждения и способствуют репарации ДНК 6. Помимо непосредственного участия в ремонте, дополнительные роли были описаны для 53BP1 в ГДР, например, регулирование внутри-S контрольно-пропускном пункте, G2 / M контрольно-пропускного пункта, и активация белка ниже по течению DDR 7-9. Недавно было обнаружено, что 53BP1 не образует очаги в ответ на повреждение ДНК индуцированных во время митоза, вместо ожидания для клеток, чтобы войти G1 до локализации в окрестности DSBs 6. DDR белки, такие как 53BP1 были найдены общаться с митотической структур (таких, как кинетохоры) во время их прохождения митоза 10.
В этом протоколе описываются использования 2 – и 3-D изображений живых клеток, чтобы визуализироватьформирование 53BP1 очагов в ответ на ДНК-повреждающих агентов камптотецин (CPT), а также поведение 53BP1 во время митоза. Камптотецин является ингибитором топоизомеразы I, что в первую очередь вызывает DSBs во время репликации ДНК. Для этого мы использовали ранее описанных 53BP1-mCherry флуоресцентный белок слияния построить, состоящий из 53BP1 домена белка способен связывать DSBs 11. Кроме того, мы использовали гистона H2B-GFP флуоресцентный белок слияния построить в состоянии контролировать динамику хроматина протяжении клеточного цикла, но, в частности, во время митоза 12. Изображений живых клеток в нескольких измерениях является отличным инструментом для углубления нашего понимания функции белков DDR в эукариотических клетках.
Поддержание целостность генома имеет решающее значение для выживания клеток. Неспособность сохранить геном приводит к преждевременному старению, канцерогенеза, или смерть 8. Существует повышенный интерес взыскательных как DDR функций, вытекающих из его значение как фундаментал?…
The authors have nothing to disclose.
При частичной поддержке R01NS064593 и R21ES016636 (KV). Микроскопия была выполнена в VCU – отдел фонда микроскопии нейробиологии и анатомии, поддерживается, в частности, с финансированием из NIH-NINDS центра основного гранта 5P30NS047463. Вращающийся диск конфокальной микроскопии был приобретен с NIH-NCRR премии (1S10RR027957).
Product | Company |
CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
MEM media | GIBCO |
Non-essential amino acids | GIBCO |
Amino acids | GIBCO |
Vitamins | GIBCO |
Sodium Pyruvate | Invitrogen |
Penicillin/Streptomycin | HyClone |
Fetal Bovine Serum | GIBCO |
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
SuperFect | Qiagen |
Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |