内向き整流カリウム(KIR)ハイスループット化合物スクリーニングのためのチャネルの活性を測定するための定量的な蛍光アッセイを開発し、検証するための方法が提示されます。
内向き整流カリウム(KIR)チャネルファミリーの特定のメンバーは、高血圧、心房細動、疼痛1,2を含む様々な疾患のために創薬ターゲットを想定しています。しかし、ほとんどの場合、それらの治療法としての可能性、あるいは基本的な生理機能を理解するための進捗状況は良い薬理学的ツールの不足により減速されています。確かに、内向き整流ファミリーの分子薬理学は、ナノモル親和性のための番号電位依存性カリウム(KV)チャネルのS4スーパーファミリーのそれより大幅に遅れていると選択性の高いペプチド毒素変調器は3が発見されました。ハチ毒毒素tertiapin及びその誘導体は、Kir1.1とKir3チャネル4,5の強力な阻害剤であるが、ペプチドは実験だけでなく、治療的に使用が制限され、その抗原特性と貧しい生物学的利用能、代謝安定性、組織浸透度に起因しています。強力の開発改良された薬理学的特性を有する選択的低分子プローブは、完全にキールチャネルの生理機能と治療の可能性を理解するための鍵となるでしょう。
学術、科学者がより良い薬理6必要としている分子標的とするシグナル伝達経路のためのプローブディスカバリキャンペーンを開始するために、米国立衛生研究所によってサポートされて分子ライブラリプローブプロダクションセンターネットワーク(MLPCN)は、衛生研究所(NIH)の共通基金の機会を作成しています。 MLPCNは、業界規模スクリーニングセンターや医薬品化学研究者にアクセスを提供し、インフォマティクス、遺伝子や遺伝子ネットワークの機能を解明する小分子プローブを開発するためにサポートしています。 MLPCNにエントリを得るための重要なステップは、ハイスループットスクリーニング(HTS)に適している堅牢なターゲットまたは経路特異的アッセイの開発である。
ここでは、蛍光ベースのタリウム(Tl +)フラックスASSAを開発する方法について説明しハイスループット化合物スクリーニングのための7,8,9,10キールチャネル機能のy。アッセイは、Kの透過性K +同族TLにチャンネル孔+に基づいています。市販の蛍光TL +レポーター色素が細孔を通過Tlの貫通フラックス+を検出するために使用されます。 BTC、FluoZin-2、7,8 FluxOR:TL +フラックスアッセイに適している少なくとも3市販の染料があります。このプロトコルはFluoZin-2を用いたアッセイの開発について説明します。もともと亜鉛指標として開発·販売していますが、FluoZin-2展示Tlの時に蛍光発光+結合で堅牢かつ用量依存的に増加。 FluxORは7,8使用可能だったので9,10を行うために続けている前に、我々はFluoZin-2で働き始めた。しかし、彼らの特定のnに最も適した染料アッセイ開発の手順は、すべての3つの色素について本質的に同一であるため、ユーザーは判断する必要がありますeeds。またMLPCNへのエントリーのために考慮されることで合意されている必要がありアッセイの性能ベンチマークを議論する。 TL +は容易にほとんどのK +チャネルに浸透しているので、このアッセイは、ほとんどのK +チャネルターゲットに適応する必要があります。
データ処理:いったんデータが収集され、分析の一般的なステップは、実験の最初にF 0を初期値に各ウェルの蛍光応答、Fを、正規化が含まれます。これは、一般的に"静的比"と呼ばれ、 "F / F 0"に象徴される。F0を指示薬色素によって支配されている例では静的比率演算が実質的に、このような照明、信号コレクション内disuniformities…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、国立保健研究所(NIH)の助成金の1R21NS073097-01と1R01DK082884(JSD)と国立衛生研究所の助成金PIER11VCTRための財団からの資金によって支えられている。
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pcDNA5/TO | Invitrogen | V1033-20 | Tetracycline-inducible expression vector |
T-REx-HEK293 cells | Invitrogen | R71007 | Tetracycline-inducible cell line |
Lipofectamine LTX/Plus Reagent | Invitrogen | 15338100 | Transfection reagent |
FBS | ATLANTA Biologicals | S11550 | Cell culture media |
DMEM | Invitrogen | 11965 | Cell culture media |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | Cell culture media |
Blasticidin S | Invitrogen | R210-01 | Cell culture media |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | Cell culture media |
HBSS-divalent free | Mediatech | 21022CV | Cell washing |
Trypsin-0.25% | Mediatech | 25053CI | Cell dissociation |
Tetracycline-HCl | Sigma | T9823 | Induction reagent |
Dialyzed FBS | ATLANTA Biologicals | S12650 | Plating media |
FluoZin-2 | Invitrogen | F24189 | Fluorescent dye |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P-3000MP | Dye loading |
HBSS | Invitrogen | 14175 | Assay buffer |
HEPES | Invitrogen | 15630 | Assay buffer |
NaHCO3 | Sigma | S6297 | Tl+ stimulus buffer |
MgSO4 | Sigma | M2643 | Tl+ stimulus buffer |
CaSO4•2H2O | Sigma | C3771 | Tl+ stimulus buffer |
D-Glucose | Sigma | G7528 | Tl+ stimulus buffer |
Thallium sulfate | Aldrich | 204625 | Tl+ stimulus buffer |
HEPES | Sigma | H4034 | Tl+ stimulus buffer |
DMSO | Sigma | D4540 | Solvent |
Eight-channel electronic pipettor | Biohit | E300 | Cell plating in 384-well plates |
BD PureCoat amine-coated 384-well plates | BD Biosciences | 356719 | Assay microplates |
Echo qualified 384-Well polypropylene microplate (384PP) | Labcyte | P-05525 | Compound source microplates |
384-well polypropylene microplates | Greiner Bio-One | 781280 | |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
ELx405 microplate washer | BioTek | ELx405HT | Automated cell washing |
Echo liquid handler | Labcyte | Labcyte Echo 550 | |
Bravo automated liquid handling platform | Agilent Technologies | Standard model | |
Hamamatsu FDSS 6000 | Hamamatsu | Kinetic imaging plate reader |
Table 1. List of Materials and Reagents.