Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zur direkten Messung der Muskelkraft, Muskelkraft, kontraktile Kinetik und Ermüdbarkeit der isolierten Skelettmuskulatur in einem<em> In vitro</em> System mit Feld Stimulation. Wertvolle Informationen über Ca^{2 +} Handhabungseigenschaften und kontraktilen Maschinen des Muskels kann unter Verwendung verschiedener Protokolle stimulierenden werden.

Abstract

Hier beschrieben ist ein Verfahren, um die Kontraktilität von isolierten Skelettmuskeln messen. Parameter wie Muskelkraft, Muskelkraft, kontraktile Kinetik, Ermüdbarkeit und Erholung nach Ermüdung erhalten, um spezifische Aspekte der Erregung und Kontraktion Kupplung (ECC) Verfahren wie Erregbarkeit, kontraktilen Maschinen und Ca ^{2 +} Handhabbarkeit zu beurteilen. Diese Methode entfernt die Nerven und Blutversorgung und konzentriert sich auf die isolierten Skelettmuskel sich. Wir routinemäßig verwenden diese Methode, um genetische Komponenten, die die kontraktilen Eigentum der Skelettmuskulatur zu verändern, obwohl modulierenden Ca ^{2 +} Signalwege zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein neu identifiziertes Skelettmuskel Phänotyp, dh mechanische Alternans, als Beispiel für die verschiedenen und vielfältigen Informationen, die unter Verwendung der in vitro-Assay kann Muskelkontraktilität werden. Kombination dieses Assays mit einzelnen Zell-Assays, genetische Ansätze und biochemistry Assays können wichtige Einblicke in die Mechanismen der ECC in der Skelettmuskulatur bieten.

Introduction

Skelettmuskeln Knochen des Skeletts befestigt und erzeugen kontraktilen Kräfte unter der Kontrolle des zentralen Nervensystems. Elektromechanische Kopplung (ECC) bezieht sich auf den Prozess der Umwandlung eines elektrischen Stimulus an eine mechanische Reaktion. Ca ^{2 +-Signal} ist eine wesentliche Komponente des kontraktilen Funktion in der Skelettmuskulatur. Effektive Ca ^{2 +} Mobilisierung von sarkoplasmatischen Retikulum (SR) ist ein wichtiger Bestandteil für die ECC in den Muskelzellen ^{1, 2,} und Veränderungen in der intrazellulären Ca ^{2 +-Signalisierung} unterliegen den entsprechenden kontraktile Dysfunktion in einer Reihe von Muskelerkrankungen ^3-5. Sachgemäßen Beurteilung Muskelkontraktilität ist wichtig und komplementär zu Ca ^{2 +-Imaging} und andere Assays, um Einblicke in Skelettmuskeln Funktion zu erhalten, nicht nur bei der kontraktilen Ebene, sondern auch auf dem kinetischen Niveau. Kraft und Geschwindigkeit kann auch erhalten, um die wichtige Eigenschaft informierenMuskelkraft und der Status der ECC-Prozess unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen.

Diese fruchtbare Gebiet der Forschung hat eine sehr reiche Geschichte und viele Theorien der Muskelkontraktion erschien über zwei Jahrtausende ^6. Modernes Muscle Research beginnt wahrscheinlich in 1674-1682 mit der mikroskopischen Beobachtung der Querstreifung und Myofibrillen in Muskelfasern durch Leeuwenhoek ^6. Fast ein Jahrhundert später, bemerkte Luigi Galvani that frog Muskel kontrahiert kräftig, wenn ihre Nerven mit Skalpell während einer Funkenentladung von einem entfernten elektrischen Maschine ^7-9 berührt. Kontraktion könnte auch durch die Verbindung des Beines Nerv zum Muskel durch einen metallischen Leiter hergestellt werden. Die Einzelheiten des komplexen elektrischen Signalisierung Mechanismus, durch Galvani befürwortet wurden schließlich von Hodgkin, Huxley und Katz in ihrem berühmten Gleichung ^{10, 11,} die das Fundament der Elektrophysiologie wurde formuliert. Die bemerkenswerte Beobachtungen von Ringer über die Auswirkungen von extrazellulärem Ca ^{2 +} auf die Kontraktilität der Frosch Herz-und Skelettmuskulatur ^12-15 stellen den ersten großen Schritt in der Anerkennung der Ca ^{2 +} als zentraler Regulator der Muskelkontraktilität ^{16, 17.} Von den 1980er Jahren bis in die Gegenwart ein Platzen der Entdeckungen in der Muskelkontraktilität Feld wurde durch die Einführung der Muskelkontraktilität und Ermüdbarkeit Protokolle in murine Skelettmuskulatur ¹⁸ realisiert. Jones und Edwards waren die ersten, dass niederfrequente intermittierende Müdigkeit (exercise-induzierte Reduktion in Kraft) schlagen ¹⁹ mit Veränderungen in der ECC Maschinen und nicht die kontraktilen Apparates verbunden war. In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren wurden Kolkeck et al ^20, Kolbeck und Nosek ²¹ und Reid ²² mit Zwerchfell von Tiermodellen, die Auswirkungen der Theophyllinen, cortiosterone und freie Radikale auf die Skelettmuskulatur Kontraktilität studieren, während Brooks und Faulkner waren die ersten, die auf Messungen der wiederholten Kraft und Leistungsmessungen in schnell und langsam Muskeln von Mäusen ²² hinweisen. Darüber hinaus waren Lannegren, Westerblad, Lamb und Westerblad die erste direkte Verbindung ex vivo Kontraktilität mit intrazellulären Ca ^{2 +-Regulation} und begann Infragestellung der Rolle der Azidose bei Muskelermüdung ^{23, 24.}

Unsere Labors haben sich seit Beginn des Jahres 2000 zum Verständnis neuartiger Gene mit modulatorische und regulatorischen Aufgaben auf Muskel-ECC mit kritischen Rollen in Muskelkontraktilität, Ermüdbarkeit und Alterung durch eine Kombination von intakten Maus Muskelkontraktilität Studien beigetragen, intrazelluläre Ca ^{2 +-Überwachung} in intakt und gehäutet Muskelfasern und molekular-genetische Manipulationen ^{3-5, 25-29.}

Hier haben wir die experimentelle Protokoll für die Messung Kontraktilität murine isolierten soleus und extensor digitorum longus (ED detailliertL) Muskeln, die zu entsprechen einer meist langsam oxidative (Typ I und IIa Muskelfasern) und ein meist schnell glyocolytic Muskeln (Typ IIb und IIx Muskelfasern) mit unterschiedlichen kontraktilen Eigenschaften. In diesem Protokoll wurden intakte Muskel-Sehnen-Komplexe isoliert und badete in einem ADI PowerLab Radnotti Kammer-System mit reinem Sauerstoff oder einem Gemisch aus Sauerstoff (95%) und CO ₂ (5%) geliefert. Kontraktilen Kräften wurden von elektrischen Stimulationen von einem Grass-Stimulator erzeugt und detektiert mit einem Kraftaufnehmer, der mit einem ADI PowerLab/400 integriert wurde, so dass die Anpassung von Makro-Routinen für die Erfassung, Sammlung, Digitalisierung und Speicherung von Daten zu steuern. Dieser Aufbau kann zu messen Muskelkraft, Muskelkraft, sowie die Kraft-Frequenz-Beziehung, Muskelermüdung, Erholung von Muskelermüdung, Geschwindigkeit und insgesamt kinetischen Eigenschaften der Muskelkontraktion. Darüber hinaus können die Auswirkungen von Medikamenten auf Muskelkontraktion durch diesen Versuchen beobachtet werden. </p>

Die Vorteile dieser Methode liegen bei der Beseitigung der neuronalen und vaskulären Komponenten vom Skelettmuskel, die eine direkte Beurteilung der inhärenten Eigenschaften der kontrahierenden Muskel. Darüber hinaus ermöglichen ex vivo Assays Kontraktilität Manipulation der extrazelluläre Milieu umgebenden isolierten Muskeln, die die Verwendung von pharmakologischen Manipulationen verschiedener Ionenpermeation Kanäle und Transporter um ihre physiologischen Rollen für Skelettmuskel Funktion definieren kann.

Diese ex vivo-System hat uns erlaubt, vor kurzem entdecken eine deutliche Alternan Verhalten in bestimmten mutante Muskel-Präparaten, die zu veränderten intrazellulären Ca ² verbunden waren ⁺ Handling-Eigenschaften ^4. Alternans als schwankende Burst Episoden kontraktile Kraft während der Rückgang Phase der Ermüdung definiert. Während dieser Veranstaltungen kontraktilen Kräfte kurz über seinen früheren Kraftniveau d zu erhöhenährend ermüdend Stimulation, vielleicht, weil entweder mehr Ca ^{2 +} freigesetzt wird oder die kontraktilen Maschinerie geworden empfindlich auf Ca ^{2 + 30.} Behandlung von Cyclopiazonsäure (CPA), einem reversiblen Blocker des sarkoplasmatischen-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase (SERCA), Koffein, ein Agonist des Ryanodin Kanal (RyR) und wiederholte ermüdend Stimulationen können alle mechanischen induzieren Alternans ^4, was darauf hindeutet, dass die Alternans direkt an Verwandte Modulation des EG Kopplung Prozess. Demonstration der Methode zu induzieren und aufzeichnen Mechaniker alternans in in vitro Kontraktilität Setup dient als Beispiel für die vielfältigen experimentellen Parameter, die mit diesem System oder ähnliche erhalten werden, könnten auf der Grundlage individueller Forschungsinteressen zu zeigen.

Diese Methode kann von Interesse für die Forscher studieren Muskelphysiologie sein. Ähnliche Setup kann auch für isolierte Skelett muscle-tendon/ligament Komplexen von anderen verwendet werdenanatomischen Stellen, sowie für einzelne Fasern und Muskelstreifen.

Protocol

Zusammensetzung der Lösung: 2,5 mM Ca 2 + Tyrodelösung: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM Glucose 0 mM Ca 2 + Tyrodelösung: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, 0,1 mM Ethylenglykol tetraessigsäure (EGTA) und 10 mM Glucose Anmerkung: Badelösung sollte mit 100% O 2, wenn mit dem oben genannten Lösung, aber mit 95% O <…

Discussion

Messung der Kontraktionskraft und Ermüdbarkeit ist für die umfassende Beurteilung der Skelettmuskulatur Funktion wichtig. Der Hauptzweck dieses Tests ist es, Veränderungen in Muskelkraft und ermüdend Eigenschaften unter bestimmten pathologischen Bedingungen, wie Sarkopenie und Muskelermüdung zu identifizieren und die Wirkung von Medikamenten / Reagenzien auf Muskelkontraktilität testen. Da die Muskelkraft ist eng mit der intrazellulären Ca ^{2 +-Freisetzung} aus, extrazelluläre Ca ^{2 +-Eintrag} …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5