Questo protocollo descrive una regolare manutenzione e cura per mantenere le condizioni ottimali per zebrafish allevamento. Il video illustra il protocollo per la manutenzione del sistema, regolarmente ad una casa, l'alimentazione, l'allevamento, e l'aumento di larve di zebrafish.
Questo protocollo descrive la cura e la manutenzione regolare di un laboratorio zebrafish. Zebrafish stanno guadagnando popolarità nel campo della genetica, la ricerca farmacologica e comportamentale. Come un vertebrato, parti zebrafish considerevole genetica similarità di sequenza con gli esseri umani e vengono utilizzati come modello animale per varie patologie umane. I vantaggi di zebrafish in confronto ad altri modelli di vertebrati comuni includono fecondità elevata, bassi costi di manutenzione, embrioni trasparenti, e di rapido sviluppo. A causa della sperone di interesse per la ricerca zebrafish, la necessità di stabilire e mantenere una struttura alloggiativa produttiva zebrafish è in aumento. Sebbene la letteratura è disponibile per il mantenimento di un laboratorio zebrafish, un protocollo video concisa manca. Questo video illustra il protocollo di abitazioni regolari, alimentazione, riproduzione e allevamento di larve di zebrafish. Questo processo consentirà ai ricercatori di comprendere il comportamento naturale e le condizioni ottimali di zebrafish allevamento e quindi risolvere i problemi sperimentali che provengono da condizioni di allevamento dei pesci. Questo protocollo sarà di grande aiuto per i ricercatori che intendono creare un laboratorio zebrafish, e anche a studenti laureati che intendono utilizzare zebrafish come modello animale.
Zebrafish provengono dal fiume Gange nel nord dell'India e stanno diventando sempre più popolare nel campo della ricerca, sia con gli adulti e stadi larvali 2, recensione da Spence et al. 3. Zebrafish in possesso di diversi vantaggi rispetto ad altri modelli animali, come fecondità elevata, facilità di manutenzione, la clearance ottica di embrioni, il rapido sviluppo embrionale, e bassi costi di manutenzione. Esse sono suscettibili di manipolazione genetica 6 e adatto per high throughput screening di farmaci 4,5. Loro fecondazione è esterna che è vantaggioso per il loro uso da biologi dello sviluppo. Grazie a queste caratteristiche favorevoli, pesce zebra stanno guadagnando popolarità in genetica 7, farmacologico 8 e ricerca comportamentale 9,10. Ci sono una serie di sfide per mantenere un impianto di zebrafish e allevamento zebrafish per ottenere embrioni. Qui, descriviamo le nostre esperienze e le raccomandazioni per affrontare queste sfide e outline un protocollo per la manutenzione del sistema, alimentazione, allevamento e raccolta delle larve.
Manutenzione del sistema
Per mantenere zebrafish in condizioni di buona salute, è importante fornire loro un ambiente pulito in un sistema di acquario ben funzionante. Una parte importante di questo sistema sta cambiando filtri regolarmente in modo che tutti i serbatoi ricevono corretto flusso d'acqua e acqua pulita. E 'fondamentale per evitare il fallimento della fornitura d'acqua in bicicletta per ogni serbatoio a causa di tubi di sistema bloccati. I tubi possono essere puliti con una portata superiore a quella normale, la pressione dell'acqua e se il blocco si verifica. Idealmente, circa il 10% di acqua del sistema dovrebbe essere sostituito ogni giorno per mantenere una buona qualità dell'acqua. In alternativa, l'acqua può essere sostituito durante la sostituzione della scatola metallica o di un filtro al carbonio. Questo assicura che lo sporco depositato nei tubi di collegamento questi filtri viene rimosso. La qualità dell'acqua deve essere controllata regolarmente. Parametri come l'alcalinità, pH, temperature, durezza, ammoniaca, ossigeno disciolto, salinità, conducibilità e dovrebbe essere considerata come fattori importanti che rappresenta la qualità dell'acqua dell'impianto (vedi Tabella 2 per i dettagli). Al nitrato meno, il pH e la temperatura devono essere monitorati regolarmente per garantire una buona qualità dell'acqua per zebrafish abitazioni. Ideale nitrato (NO 3 -) livelli sono <50 mg / L 11; alta se questi livelli può essere ridotto sostituendo l'acqua nel sistema di circolazione con il sistema di acqua fresca. Di tanto in tanto, i filtri non si adattano bene e perdere quindi si consiglia di verificare la presenza di eventuali perdite dopo una sostituzione del filtro. Se il flusso di acqua dal serbatoio principale è bloccato o dopo aver cambiato la pompa dell'acqua o sostituire un filtro, il flusso d'acqua può essere ripristinata o allentare o rimuovere il filtro per alcuni secondi per rilasciare il vuoto viene generato nei tubi. Il tempo necessario per cambiare i filtri possono variare a seconda di vari fattori come il carico totale o biologican il sistema, la pulizia di filtri altri, e lo sporco depositato nei tubi. Di conseguenza, i filtri devono essere immediatamente sostituiti se appaiono sporchi o se tutti i serbatoi non ricevono la corretta alimentazione dell'acqua. Si raccomanda inoltre che il pesce netto essere puliti con etanolo al 70%, e risciacquato con acqua per decontaminare, e lasciati asciugare prima di essere riutilizzati. Essiccazione garantisce evaporazione di etanolo che altrimenti è tossico per i pesci.
La maggior parte dei sistemi di zebrafish utilizzare de-clorurati acqua del rubinetto, ma alcuni sistemi usare acqua deionizzata. È importante mantenere la conducibilità dell'acqua di sistema tra 300 e 1.500 ~ mS quanto riduce l'energia del pesce deve mantenere sali corporei. Pertanto, zebrafish non può essere conservato in acqua deionizzata a meno sali sono aggiunti per mantenere i livelli ottimali di conducibilità. Vi è il rischio di possibili concentrazioni elevate di rame in acqua di rubinetto sistema se viene utilizzato perché il filtro al carbone non rimuove rame. Pertanto, users dovrebbe verificare per le concentrazioni di rame e tubazioni di rame evitare, ove possibile.
Alimentazione
Zebrafish non dovrebbe mai essere sovralimentati in quanto ciò può aumentare il livello di nitrati nell'acqua, la riduzione dei suoi allevamento 11, o la vitalità, come alcuni pesci possono morire a causa di eccesso di cibo. Si consiglia di fornire più cibo nel corso di uno di alimentazione di un serbatoio di pesce può finire in 10 minuti. E 'molto importante per eliminare il sale dai artemie prima di espellerle alla zebrafish come concentrazione di sale in eccesso provoca la morte. Se uova zebrafish sono necessari più, pesce può essere alimentato tre volte al giorno. Pulizia dei serbatoi allevatore di pesce tutti i giorni migliora anche i livelli di produzione di uova.
Durante l'alimentazione sui sistemi acquatici habitat di solito spegnere la pompa dell'acqua e la pompa d'aria per permettere al pesce di mangiare il cibo per 10 minuti. Questo diminuisce la quantità di cibo che viene lavata nei filtri. Tuttavia, gli utenti devono fare attenzione a remEmber per accendere queste pompe di nuovo in seguito.
Allevamento
Zebrafish sono di solito in condizioni di allevamento ottimale tra ~ 3 e 18 mesi di età. Allevamento a coppie non deve essere eseguita per due giorni consecutivi, 11; tuttavia, in vasca da riproduzione può essere effettuata tutti i giorni come un serbatoio può contenere molti pesci che riduce la possibilità della stessa coppia di pesci vengono allevati per due giorni di fila. Allevamento dovrebbe essere effettuata ad intervalli regolari, anche se le uova non sono necessarie. Questo processo assicurarsi che il ciclo di allevamento del pesce è mantenuta. Si raccomanda che non ci sono più femmine che maschi in un allevamento di set-up. Zebrafish Maschio cambiare le loro partner femminili su un 12 base giornaliera che supporta ulteriormente questa raccomandazione. Inoltre, nel nostro laboratorio abbiamo inizialmente avuto problemi con l'allevamento, tuttavia, utilizzando più femmine che maschi in un allevamento di set-up aiutato a risolvere il problema. Inoltre, alimentando con una proteina conte altont dieta e artemia due-tre volte al giorno, pesce di miscelazione da serbatoi diversi (diversi dai genitori), mantenendo la temperatura del allevamento set-up tra 27 e 28 ° C, e stringendo la pancia delle femmine con tubi ovariche bloccate con leggero massaggio ulteriormente migliorato la produzione di uova. Si consiglia di mantenere una registrazione di linee di pesce / origini per evitare in-allevamento tra fratelli. Questo incrementa la produzione di embrioni. Mantenere una registrazione del numero di embrioni di cui cattura di pesci di ogni serbatoio è anche raccomandato. Questo aiuta a mantenere una traccia delle vasche di allevamento dei pesci migliori e prendere misure volte a migliorare l'allevamento del pesce non deporre le uova.
Allevamento di larve
Alimentazione delle larve dovrebbe iniziare da 5 dpf (giorni dopo la fecondazione). Larve giovani possono essere nutriti con cibo secco di circa 100 micron di dimensione (ad esempio, ZM100) o cibo vivo come paramecio e rotiferi (che stimola la crescita). La dimensione cibo può essere aumentata lentamentea 200 micron (es. ZM200) o 300/400 micron (es. ZM300). Una popolazione di pesci adulti dovrebbe essere di circa 6-7 pesci per litro d'acqua. Questa pratica è consigliata per una migliore manutenzione della BOD (domanda biologica di ossigeno) ai serbatoi.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Tammy Esmaili per la sua assistenza nella gestione dei materiali di consumo di laboratorio. AA è il destinatario di una borsa di studio di dottorato di ricerca del Centro di Eccellenza per la ricerca sulle malattie di Alzheimer e cura, Scuola di Scienze Mediche, Edith Cowan University. MC riceve il dottorato sostegno finanziario del Rotary Club, Perth. AM, GV, KT, e la RNM sono finanziati dalla fondazione di ricerca della malattia di Alzheimer di McCusker.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | |
Zebrafish circulating system | Aquatic Habitats, USA | AHAB stand-alone, bench-top systems | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | |
Fish food dispenser/Dry food feeder | Aquatic Habitats, USA | AH19 | |
Microscope | Olympus | SZX12 | |
Dry Food | ZM Fish food, UK | ZM100, ZM200, ZM300 | |
Brine shrimp eggs | Salt Creek, Inc., USA | Premium Grade | |
In-tank breeders | Aquatic Habitats, USA | ITSTS-A | |
Activated carbon | Penn-Plax Pro-crab, USA | PBC3MF | |
Breeding tanks | Aquatic Habitats, USA | SBTANK (1L) Breeder Tank-2 (2L) |
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Red sea salt | Red sea salt, USA | Local pet store/ www.redseafish.com |
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Filters (Canister, filter pads, and UV) | Aquatic Habitats, USA | aquatichabitats.com | |
Siporax Media | Aquatic Habitats, USA | BF 820 | |
Brine shrimp net | Aquatic Habitats, USA | BSN 1 | |
Brine shrimp hatcher | Aquatic Habitats, USA | BS252 | |
Baffles | Aquatic Habitats, USA | aquatichabitats.com | |
Table 1. Table of specific reagents and equipment used in this protocol. |