病原体胞の精製から<em>レジオネラ菌</em>感染した食細胞
Summary
この資料では、無傷の単離および精製する方法を説明します<em>レジオネラ菌</emアメーバやマクロファージからの>を含む液胞（商用車）。 2ステップのプロトコルは、密度勾配遠心法により細菌のLCVマーカー、さらに精製することに対する抗体を用いた免疫磁気分離による濃縮LCVで構成されています。
Abstract
日和見病原体レジオネラはまた、このように重症肺炎"レジオネラ症" 1の原因となる肺胞マクロファージで複製アメーバ耐性菌です。原生動物や哺乳類の食細胞で、L.レジオネラは 、特定の複製許容コンパートメント、 " レジオネラ菌を含む液胞"（LCV）を形成するために保存されたメカニズムを採用しています。 LCVの形成は、宿主細胞に、多くの275 "エフェクター"のタンパク質を移行し、細菌ICM /ドットIV型分泌系（T4SS）が必要です。エフェクターは宿主タンパク質と同様に脂質を操作し、分泌、エンドソームやミトコンドリアの細胞内小器官2から4と 通信します。
小型商用車の形成は、還元の方法で把握することが困難であり、複雑な堅牢かつ冗長なプロセスを表します。統合的なアプローチは、パスのグローバルな分析を含む、包括的にLCVの形成を理解する必要がありますogen – 宿主因子の相互作用とそれらの時間的および空間的ダイナミクス。この目標に向けた第一歩として、無傷の商用車は、プロテオミクスとリピドミクスで精製し、分析されます。
組成や病原体を含有する液胞の形成は、液体クロマトグラフィーや質量分析に結合された2-Dゲル電気泳動を用いたプロテオーム解析により検討されています。社会的な土壌アメーバキイロタマホコリカビや哺乳類の食細胞のいずれかから単離された小胞は、 リーシュマニア 5、 リステリア菌 6 菌 7、 ロドコッカス 8、 サルモネラ 9またはレジオネラ属菌をかくまった10。彼らは、例えば電子顕微鏡は、LCVの形態、整合性と純度を分析する必要がしかし、これらの研究で用い精製プロトコルは、時間のかかる退屈な作業です。さらに、これらのプロトコルは、専用のために病原体胞の特定の機能を利用しないrichment。
ここで紹介する方法は、Dを用いることにより、これらの制限を克服ホスファチジルイノシトール4 -リン酸（PtdIns（4）P）3,11に結合することにより、蛍光LCVマーカーを生産し、細菌のエフェクタータンパク質SIDCを対象に、どのLCV膜に選択的にアンカーでdiscoideumの 。小型商用車は、古典的Histodenz密度勾配遠心分離12,13（ 図1）第二段階に続いて磁気ビーズに結合されたSIDCと二次抗体に対するアフィニティー精製一次抗体を使用して、免疫磁気分離による最初のステップで濃縮され。
D.から単離された小型商用車のプロテオーム研究discoideumのは 13前にLCVの形成に関与していない食胞、ミトコンドリア、小胞体とゴルジ体と同様に、いくつかの低分子量GTPase、関連付けられたタンパク質を含む560以上の宿主細胞タンパク質を、明らかにした。小型商用車はで濃縮および精製プロトコルは、さらに顕微鏡（免疫蛍光法、電子顕微鏡）、生化学的方法（ウエスタンブロット）およびプロテオミクスまたはlipidomicアプローチによって分析することができますここで概説した。
Protocol
Discussion
以前に公開された方法とは対照的に、このプロトコルは、2つのステップは、最初の免疫磁気アプローチによる小型商用車の分離、そして第二に、密度勾配遠心分離により小型商用車の精製に基づいています。 LCVの分離が容易に蛍光標識した細菌やGFP産生細胞または抗体染色のいずれかが使用されている蛍光顕微鏡、続くことができます。ここで説明するプロトコルは、高純度の小型商用車?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちのラボでの研究は、マックス·フォン·ペッテンコーファー研究所、ルートヴィヒ·マクシミリアン大学、ミュンヘン、ドイツ研究協会（DFG、HI 1511/3-1）とBundesministeriumエリーゼBildungウントForschung（BMBF） "医療感染ゲノム"イニシアティブによってサポートされていました（ 0315834C）。
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