Summary

Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation

Published: July 23, 2012
doi:

Summary

Les microglies sont les macrophages résidents qui fournissent la première ligne de défense et de la surveillance immunitaire du système nerveux central. Les microARN sont des molécules régulatrices qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques, y compris l'activation et la différenciation des macrophages. Dans cet article, nous décrivons la méthode de mesure des microARN dans la microglie.

Abstract

Microglie sont des cellules de la lignée myéloïde qui résident dans le système nerveux central (SNC) 1. Ces cellules jouent un rôle important dans les pathologies de nombreuses maladies associées à la neuroinflammation tels que la sclérose en plaques (MS) 2. La microglie dans quelques SNC normal exprimer macrophages marqueur CD11b et présentent un phénotype de repos en exprimant de faibles niveaux de marqueurs d'activation tels que CD45. Lors d'événements pathologiques dans le système nerveux central, la microglie sont activés tel que déterminé par la régulation positive de CD45 et d'autres marqueurs 3. Les facteurs qui influent sur le phénotype des microglies et les fonctions dans le SNC ne sont pas bien étudiés. Les microARN (miARN) sont une famille de plus en plus de molécules conservées (~ 22 nucléotides de long) qui sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques normaux tels que la croissance et la différenciation cellulaire 4 et pathologies telles que l'inflammation 5. MiARN régulent à la baisse l'expression de certains gènes cibles en se liant des séquences complémentaires de laARNm ir et de jouer un rôle important dans l'activation des cellules immunitaires innées dont les macrophages et la microglie 6 7. Afin d'étudier les voies médiées par miRNA qui définissent le phénotype des microglies, la fonction biologique, et de distinguer les microglies d'autres types de macrophages, il est important d'évaluer quantitativement l'expression de microARN spécifiques dans des sous-ensembles distincts de SNC-résident microglie. Les méthodes courantes pour mesurer l'expression des miARN dans le SNC comprennent la PCR quantitative à partir de tissu neuronal et de toute hybridation in situ. Cependant, la PCR quantitative à partir de broyat de tissu ensemble ne permet pas l'évaluation de l'expression de miARN dans la microglie, qui ne représentent que 5-15% des cellules de tissu neuronal. Hybridation in situ permet l'évaluation de l'expression de microARN dans des types cellulaires spécifiques dans les coupes de tissus, mais cette méthode n'est pas entièrement quantitative. Dans ce rapport, nous décrivons une amélioration quantitative et sensitive méthode pour la détection de miARN par PCR en temps réel dans la microglie isolés de SNC normal ou pendant l'utilisation neuroinflammation encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), un modèle de souris pour MS. La méthode décrite sera utile pour mesurer le niveau d'expression des microARN dans la microglie dans le SNC normal ou en neuroinflammation associée à diverses pathologies, y compris MS, accident vasculaire cérébral, un traumatisme, la maladie d'Alzheimer et les tumeurs cérébrales.

Protocol

1. Isolement des cellules microgliales du SNC normal Isolement de la microglie est effectué comme cela a été décrit précédemment, avec les adaptations 3. Préparer les instruments de dissection et de la perfusion: ciseaux, pinces, une seringue de 10 ml avec aiguille 27g, 15 ml Dounce homogénéisateur (téflon / verre), 40 tamis cellulaire um nylon, 40% et 70% des solutions de Percoll, PBS 1X. Euthanasier les souris par asphyxie rapide (privation d'o…

Discussion

Récemment un intérêt significatif a été donné à la microglie et l'implication de ces cellules dans de nombreuses pathologies associées à la neuroinflammation et la neurodégénérescence. En outre, le rôle des microARN dans la différenciation des cellules immunitaires et le cancer a considérablement augmenté au cours des dernières années, plusieurs 5,10. Nous avons déjà signalé le rôle de miR-124 dans le maintien du phénotype non activé ou au repos de la microglie dans le SNC normales…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travail a été soutenu par le NIH R01 NS071039-01A1 subvention de recherche.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
1X PBS GIBCO 14190 Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
10X PBS Thermo Scientific SH30258.02 Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4
DMEM; FBS GBCO 11965; 10438  
miRVana kit Invitrogen AM1561  
Percoll Sigma P4937-500 ml 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM
50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS
MOG35-55 peptide AnaSpec Inc 60130-5  
CFA DIFCO 263810  
Pertussis Toxin Sigma P7208  
FcR blocking antibodies BD Biosciences 553142 Clone 2.4G2
Anti-CD11bPE mAb BD Biosciences 553311 Can be used with different fluorophores (e.g. AF488)
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs Biolegend 103116 Can be used with different fluorophores (e.g. APC)
Paraformaldehyde (16%) EMS Inc 15710 Dilute 1:15 in 1X PBS
15% TBE-Urea Gel Life Technologies Inc. EC68855BOX  
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit Life Technologies Inc 4366596  
TaqMan Universal PCR Master Mix Life Technologies Inc 4304437  
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a Life Technologies Inc 4427975 ID 001182  
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 Life Technologies Inc 4427975 ID 001228  
Nuclease-free water Life Technologies Inc AM9937 Nuclease-free water
384-well clear optical reaction plate Life Technologies Inc. 4309849 Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments
Dounce homogenizer (15 ml) Wheaton Science Products. 358044 Teflon/glass
40 μ nylon cell strainer Falcon 352340  
Big centrifuge Sorval RT 6000B Rotor diameter 18.5 cm
Small centrifuge Eppendorf 5415 R Rotor diameter 6.5 cm
Real-time PCR Instrument Life Technologies Inc. AB 7900 HT Can be substituted with other instruments
Flow cytometer BD Biosciencess LSR II Can be substituted with other instruments
FACS BD Biosciences FACSAria Can be substituted with other instruments
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000  

References

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Cite This Article
Veremeyko, T., Starossom, S., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (65), e4097, doi:10.3791/4097 (2012).

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