FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare
Summary
Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.
Abstract
Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia continua a guadagnare un crescente interesse come tecnica di monitoraggio in tempo reale di eventi biochimici e di segnalazione nelle cellule vive e tessuti. Rispetto ai classici metodi biochimici, questa nuova tecnologia è caratterizzata da elevata risoluzione temporale e spaziale. FRET esperimenti utilizzare vari geneticamente codificati biosensori che possono essere espresse e ripreso nel tempo in situ o in vivo 1-2. Biosensori tipici possono segnalare interazioni proteina-proteina misurando FRET tra una coppia fluoroforo-etichettato di proteine o cambiamenti conformazionali in una singola proteina che porti donatore e accettore fluorofori interconnessi con una parte che lega ad una molecola di interesse 3-4. Biosensori bimolecolari di interazioni proteina-proteina includono, per esempio, costruisce progettato per monitorare G-proteina di attivazione di cellule 5, mentre i sensori unimolecolari meaSuring cambiamenti conformazionali sono ampiamente utilizzati per messaggeri seconda immagine come calcio 6, cAMP 7-8, inositolo fosfati 9 e cGMP 10-11. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da singoli componenti disponibili in commercio e come controllare l'intero setup utilizzando il micro-Manager freeware. Questo strumento semplice ma potente è stato progettato per misurazioni di routine o più sofisticati FRET in cellule vive. Le immagini acquisite vengono elaborate utilizzando auto-scritto plug-in per visualizzare le modifiche in FRET rapporto in tempo reale in un periodo di sperimentazione prima di essere memorizzati in un formato grafico compatibile con il build-in freeware ImageJ utilizzato per la successiva analisi dei dati. Questo sistema a basso costo è caratterizzato da un'elevata flessibilità e può essere utilizzato con successo per monitorare i vari eventi biochimici e molecole di segnalazione da una pletora di biosensori disponibile FRET in cellule vive e tessuti. Come esempio, dimostriamo how utilizzare questo sistema di imaging per eseguire il monitoraggio in tempo reale di cAMP in cellule vive 293A dopo stimolazione con un β-agonista del recettore adrenergico e bloccante.
Protocol
Discussion
in questo protocollo, abbiamo spiegato come creare un semplice basso costo ma potente FRET sistema di imaging per applicazioni di routine con una varietà di biosensori disponibili. Il sistema presentato è progettato per CFP e YFP, o altri tipi di proteine fluorescenti, come donatore-accettore coppia. Nel frattempo, altri biosensori individuali diventano disponibili che utilizzano per esempio le proteine fluorescenti verdi e rosse 14. Adattare il sistema descritto per altri colori, fonti di luce …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Anke Rüttgeroth e Karina Zimmermann per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (sovvenzione NI 1301/1-1 di VON) e Università di Göttingen Medical Center ("pro futura" sovvenzione VON).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| BES Buffer Grade | AppliChem | A1062 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C5010 | |
| Glass coverslides | Thermo Scientific | 004710781 | Diameter 24 mm |
| Glass-bottomed cell-culture dishes | World Precision Instruments | FD3510-100 | |
| D-MEM medium | Biochrom AG | F0445 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Scientific | SH30073.02 | |
| L-Glutamine | Biochrom AG | K0283 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| MgCl2 hexahydrate | AppliChem | A4425 | |
| NaCl | AppliChem | A1149 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9707 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A2213 | |
| Inverted fluorescent microscope | e.g. Nikon | Request at Nikon | |
| CoolLED | CoolLED | pE-100 | 440 nm |
| DualView | Photometrics | DV2-SYS | |
| DualView filter slider | Photometrics | 05-EM | |
| CFP/YFP filter set | Chroma Technology | 49052 | without the emission filter |
| ORCA-03G camera | Hamamatsu Photonics | C8484-03G02 | |
| Arduino I/O board | Sparkfun Electronics | DEV-00666 | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | |
| Personal computer with WindowsXP or Windows7 system | Any supplier | Include hard-drive with high capacity |
References
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