Mutagenesis bisulfite הוא תקן הזהב לניתוח מתילציה בדנ"א. פרוטוקול שונה שלנו מאפשרת ניתוח מתילציה דנ"א ברמת מתחיל מתא בודד ותוכנן במיוחד עבור ביציות נפרדות. זה יכול לשמש גם המחשוף בשלב עוברי.
אפיגנטיקה מקיפה את כל תורשתי ושינויים הפיך כדי הכרומטין כי הנגישות אלתר הגן, וכך הם המנגנונים העיקריים בוויסות שעתוק הגנים 1. מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic שפועל בעיקר כסימן הדיכוי. באמצעות תוספת קוולנטי של קבוצת מתיל על cytosines ב dinucleotides CPG, הוא יכול לגייס חלבונים דיכוי נוספים ושינויים היסטון ליזום תהליכים המעורבים עיבוי הכרומטין השתקת גנים 2. מתילציה דנ"א חיוני להתפתחות נורמלית כפי שהיא משחקת תפקיד קריטי תכנות התפתחותי, התמיינות תאים, הדיכוי של אלמנטים retroviral, כרומוזום ה-X איון ו החתמה גנומית.
אחת השיטות החזקות ביותר לניתוח מתילציה בדנ"א הוא mutagenesis bisulfite. Bisulfite נתרן הוא mutagen דנ"א deaminates cytosines אל uracils. בעקבות הגברה seque PCR ו ncing, אירועים אלה המרה מזוהים כמו thymines. Cytosines מפוגל מוגנים מפני deamination ובכך להישאר cytosines, המאפשר זיהוי של מתילציה בדנ"א ברמת נוקלאוטיד יחיד 3. פיתוח assay mutagenesis bisulfite התקדמה מאלה דווח במקור 4-6 כלפי אלה הרגישים יותר לשחזור 7. אחד היה המפתח להתקדמות הטמעת כמויות קטנות יותר של דנ"א חרוז agarose, ובכך להגן על ה-DNA מטיפול bisulfite הקשה 8. ניתוח זה מתילציה מופעל להתבצע על בריכות של ביציות ו בשלב הבלסטוציסט ועוברים 9. Mutagenesis המתוחכמת ביותר bisulfite פרוטוקול עד כה היא בשלב הבלסטוציסט עוברים בודדים 10. עם זאת, מאז blastocysts יש על 64 תאים הממוצע (המכיל 120-720 PG של הדנ"א הגנומי), שיטה זו אינה יעילה ללימודי מתילציה על ביציות בודדים או מחשוף בשלב עוברים.
אוהל "> לוקח רמזים מן הטבעה agarose כמויות הדנ"א דקות כולל 11 ביציות, כאן אנו מציגים שיטה לפיה ביציות מוטבעים ישירות agarose ו תמוגה פתרון חרוז אחזור מיד לאחר והסרה של pellucida Zona מן הביצית. זה מאפשר לנו לעקוף את שני האתגרים העיקריים של mutagenesis ביצית אחת: bisulfite. המגנים על כמות זעירה של דנ"א, השפלה ואובדן הבאים במהלך השלבים פרוטוקול רבים חשוב לציין, כאשר הנתונים מתקבלים ביציות בודדות, סוגיית ההטיה PCR בתוך בריכות מסולק יתר על כן. , זיהום מכוונת התא תלולית ניתן לזהות על ידי שיטה זו שכן כל המדגם עם דגם אחד או יותר של מתילציה ניתן נכללו בניתוח 12. פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור ניתוחים מוצלחים לשעתקו של מתילציה בדנ"א ברמת מתחיל מתא בודד והוא אידיאלי עבור ביציות נפרדות, כמו גם מחשוף בשלב עוברים.זה assay ביצית אחת מכיל שלבים רבים עם מספר כי הם קריטיים ודורשים טיפול מיוחד. הראשונה היא שטיפת הביצית. זה חשוב במיוחד כדי לשטוף כל הביצית מספר פעמים בינוני טרי טיפות לאחר הטיפול hyaluronidase כדי להסיר תאים קומולוס רבים ככל האפשר. יתר על כן, בעת העברת ביציות לפתרון חומצי של tyrod…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מערב אונטריו, החוג למיילדות וגינקולוגיה, ומענק ER06-02-188 מהמחקר Ministryof וחדשנות, פרס חוקר הקדומה. אכפת נתמך על ידי תוכנית אימון CIHR ב שכפול, בהתפתחות המוקדמת ואת ההשפעה על מלגה (REDIH) בוגר הבריאות.
Table of specific reagents and equipment.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Oocyte Collection | |||
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
Proteinase K | Sigma | P5568 | |
10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
Lysis Solution | |||
Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
LiCl | Sigma | L9650 | |
EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
DTT | Invitrogen | P2325 | |
SDS Lysis Buffer | |||
TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
Bisulfite Conversion | |||
Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
M2 Medium | Sigma | M7167 | |
GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
Autoclaved double distilled (dd) water | |||
PCR | |||
Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
Inner and outer nested primers | Sigma | ||
Ligation | |||
Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
TA Cloning | |||
Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
Equipment | |||
Dissecting Microscope | |||
70°C and 90°C Heat Blocks | |||
37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
Rocker | |||
PCR machine |