בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.
רקומביננטי ביטוי החלבון חיידקים, בדרך כלל א ' coli, הייתה האסטרטגיה המוצלחת ביותר עבור ביטוי בכמות מיליגרם של חלבונים. עם זאת, המארחים פרוקריוטים הם לעתים קרובות לא בהתאם ביטוי של חלבונים אנושיים, ויראלי או האיקריוטים בשל הרעילות של מקרומולקולה החוץ, ההבדלים מכונות קיפול חלבונים, או בשל חוסר שיתוף שינויים או שלאחר translational מסוימים של חיידקים. מערכות ההבעה על בסיס שמרים (pastoris פ או cerevisiae ס) 1,2, baculovirus-נגוע חרק (ס 'frugiperda או ט' ני) 3 תאים, תא ללא במבחנה תרגום מערכות 2,4 שימשו בהצלחה לייצר חלבונים יונקים. באופן אינטואיטיבי, את ההתאמה הטובה ביותר היא להשתמש המארח יונקים על מנת להבטיח את הייצור של חלבונים רקומביננטיים המכילים הנכון לאחר שינויים של תרגום. מספר שורות תאים יונקים (קיד עובריים אנושייםניי (HEK) 293, C-V-1 התאים O rigin הנושאים V40 S larget T-antigen (COS), השחלות אוגר סיני (CHO), ועוד) כבר נוצלו בהצלחה overexpress כמויות מיליגרם של מספר חלבונים אנושיים 5-9. עם זאת, היתרונות של שימוש בתאי יונקים הם לעתים קרובות הגיב עלויות גבוהות יותר, הדרישה של ציוד מעבדה מיוחד, תשואות נמוכות יותר חלבון, ושעות ארוכות לפתח יציבות התא קמטי הבעה. הגדלת התשואה חלבונים לייצר מהר יותר, תוך שמירה על עלויות נמוכות, הם הגורמים העיקריים למעבדות אקדמיים ומסחריים רבים.
כאן אנו מתארים זמן ועלות יעיל, חלק 2, הליך לביטוי של חלבונים המופרשים אדם חסיד תאים HEK 293T. מערכת זו הוא מסוגל לייצר מיקרוגרם כמויות מיליגרם של חלבון פונקציונלי ללימודי מבניים, biophysical ו ביוכימי. החלק הראשון, בונה רבות של הגן של עניין הם מייצרים ד במקביל transfected זמני אל חסיד תאים HEK 293T בקנה מידה קטן. זיהוי וניתוח של חלבון רקומביננטי מופרש לתוך המדיום תרבית תאים מבוצע על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית המכוונים נגד תג וקטור המקודד טיהור חלבונים. לאחר מכן, בונה מתאים לייצור בקנה מידה גדול חלבון transfected זמני באמצעות polyethyleneimine (PEI) ב -10 מפעלים שכבת תאים. חלבונים המופרשים לתוך ליטר למוצרי כרכים של המדיום אוויר מרוכזים לתוך כמויות לניהול באמצעות סינון זרימת משיק, ואחריו טיהור ידי כרומטוגרפיה נגד HA זיקה. השירות של פלטפורמה זו היא הוכחה על ידי היכולת שלו לבטא את כמויות מיליגרם של ציטוקינים, קולטנים ציטוקינים, קולטנים בתא השטח, גורמים פנימיים, וכן הגבלה גליקופרוטאינים ויראליים. בשיטה זו השתמשו בהצלחה גם בקביעת המבנה של 5,10 גליקופרוטאין trimeric ebolavirus.
<p cילדה = "jove_content"> לסיכום, פלטפורמה זו מציעה מהירות וקלות שימוש, ויכולת הרחבה תוך מיקסום איכות החלבון ופונקציונליות. יתר על כן, הציוד ללא תוספת, למעט תקן humidified CO 2 באינקובטור, נדרשת. הליך זה עשוי להתרחב במהירות למערכות מורכבות יותר, כמו ביטוי משותף של קומפלקסים חלבונים, אנטיגנים ונוגדנים, ייצור של וירוסים כמו חלקיקים עבור חיסונים, או לייצור של adenoviruses או lentiviruses עבור התמרה של שורות תאים קשים.את 10-שכבת מפעלים סלולריים הם כלי יעיל לייצור כמויות מיליגרם של חלבון. היתרון הגדול של שימוש מפעל התא על כלי מסורתיים אחרים, כגון בקבוקים, צלוחיות הרים לוחצים או צלוחיות תיבת הטווח, היא שהם אינם דורשים רכישת ציוד מעבדה נוספת. תקן ה-CO 2 באינקובטור (~~~HEAD=NNS 6.0 מ"ק. מט…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי HIV רשת אונטריו טיפול מחקר הפעלה גרנט (ROG-G645) וקנדה מכון פרס מחקר לחוקר הבריאות החדש (MSH-113554) כדי JEL, ואוניברסיטת טורונטו מלגות חה, FCA, וג'וינט. המחברים מבקשים להודות מארני Fusco, דפנה אבלסון וד"ר אריקה Ollmann Saphire במכון המחקר סקריפס (La Jolla, CA) עבור תאים המספקים, ebolavirus וקטור GP ביטוי וייעוץ כללי.
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution | Sigma | B6404 | |
Antibiotic/Antimycotic, 100X | Invitrogen | 15240062 | |
Anti-HA affinity matrix, clone 3F10 | Roche | 1815016 | |
Anti-HA murine mAb, clone 16B12 | Covance | MMS-101P | |
Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated | Corning | 430641 | |
Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated | Corning | 431082 | |
Cell culture plates,6-well tissue culture treated | Corning | 3516 | |
Cell factory, 10-layer CellSTACK | Corning | 3312 | |
Centramate Omega 5K Cassette | Pall | OS005C12 | |
Centramate Omega 30K Cassette | Pall | OS030C12 | |
Chromatography glass column, 1.0×10 cm | Kontes | 4204001010 | |
Ciprofloxacin | Sigma | 17850 | |
CO2 | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Sigma | D5796 | |
Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated | Invitrogen | 12484-028 | |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | 4709691001 | |
GeneJuice transfection reagent | EMD/Merck | 70967-6 | |
Glycine | Sigma | G8898 | |
Goat anti-mouse IgG F(ab’)2 alkaline | Thermo Scientific | 31324 | |
phosphatase-conjugated antibody | |||
Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg | Genscript | custom synthesis | |
(sequence: YPYDVPDYA; 95% purity) | |||
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite) | various brands are available | ||
Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH07850 | |
MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick | Invitrogen | K2100-11 | |
MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure | Invitrogen | K2100-07 | |
NaN3 | Sigma | S8032 | |
pDISPLAY expression vector | Invitrogen | V660-20 | |
Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X | Sigma | D8537 | |
Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa | Polyscience | 23966 | |
Skim milk dry powder | Carnation | ||
Stericup-GP PES vacuum filtration unit, | Millipore | SCGPU05RE | |
0.22 μm, 500 ml capacity | |||
Trypan blue | Invitrogen | 15250061 | |
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Invitrogen | 25300-054 | |
Tween-20 | Sigma | P7949 | |
Valproic acid | Sigma | P4543 | |
Centramate tangential flow system | Pall | ||
CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft. | various brands are available | ||
Electrophoresis and transfer unit | various brands are available | ||
Incubator, 37 °C | various brands are available |