Ofrecemos una manera simple, semi-cuantitativo método para investigar la formación de biopelículas<em> In vitro</em>. Este método se aprovecha de la STEMI Zeiss 2000-C Microscopio de disección (con el accesorio de cámara) para monitorear tanto el tiempo y el patrón de la formación de biopelículas, según lo evaluado por el desarrollo de colonias rugosas.
Las biopelículas, o adjuntos de superficie comunidades de células encapsuladas en una matriz extracelular, representan un estilo de vida común para muchas bacterias. Dentro de un biofilm, las células bacterianas presentan a menudo alterado la fisiología, incluyendo una mayor resistencia a los antibióticos y otros problemas ambientales 1. Además, los biofilms pueden desempeñar papeles importantes en las interacciones huésped-microbio. Las biopelículas se desarrollan cuando las bacterias de la transición individual, las células planctónicas para formar complejos multicelulares comunidades 2. En el laboratorio, los biofilms son estudiados por la evaluación del desarrollo de fenotipos específicos de biofilm. Un fenotipo biopelícula común implica la formación de colonias bacterianas arrugadas o rugosa en agar sólido medios 3. La formación de colonias arrugada proporciona un medio particularmente simple y útil para identificar y caracterizar las cepas bacterianas que presentan fenotipos alterados biofilm, y para investigar las condiciones ambientales que la formación de biofilm impacto. Wrila formación de colonias nkled sirve como un indicador de la formación de biopelículas en una variedad de bacterias, incluyendo tanto bacterias Gram-positivas, tales como 4 Bacillus subtilis y bacterias Gram-negativas, tales como Vibrio cholerae 5, 6 Vibrio, Pseudomonas aeruginosa 7, y Vibrio fischeri 8.
La bacteria marina V. fischeri se ha convertido en un modelo para la formación de biopelículas, debido al papel crítico de las biopelículas durante la colonización de acogida: biofilms producidos por V. fischeri promover la colonización de las hawaianas autotanques 10.08 calamar Euprymna scolopes. Es importante destacar que, fenotipos biofilm observados in vitro se correlaciona con la capacidad de V. fischeri células para colonizar efectivamente los animales de acogida: las cepas con discapacidad para la formación de biofilm in vitro poseen un defecto de la colonización 9,11, mientras que las cepas exhiben mayorfenotipos biofilm se han mejorado para la colonización de 8,12. V. fischeri por lo tanto, proporciona un sistema sencillo modelo para evaluar los mecanismos mediante los cuales las bacterias regulan la formación de biopelículas y cómo los biofilms la colonización impacto en el host.
En este reporte se describe un método semi-cuantitativo para evaluar la formación de biopelículas con V. fischeri como un sistema modelo. Este método implica el cuidado de manchado de cultivos bacterianos en concentraciones y volúmenes definidos sobre medios de agar sólidos; un cultivo manchado es sinónimo de una sola colonia bacteriana. Esta técnica de "cultura manchada 'puede ser utilizado para comparar los fenotipos graves de biopelículas en individuales y específicas, los puntos de tiempo (de punto final ensayos), o para identificar y caracterizar los fenotipos sutiles biofilm a través de ensayos del curso de tiempo de desarrollo de los mismos y las mediciones del diámetro de las colonias , que está influenciado por la formación de biopelículas. Así, esta técnica proporciona un análisis semi-cuantitativo de la formación de biopelículas, pormitting evaluación de los tiempos y patrones de desarrollo de la colonia arrugada y el tamaño relativo de la estructura de desarrollo, características que van más allá de la morfología general sencillo.
En este trabajo se describe un método semi-cuantitativo para evaluar la formación de biopelículas con V. fischeri como organismo modelo. Específicamente, utilizamos un microscopio de disección con el accesorio de cámara para controlar la formación de biopelículas y el desarrollo como la formación de colonias arrugada en el tiempo sobre una superficie de agar sólido. En este protocolo, se exponen dos tipos específicos de los métodos que comúnmente se utilizan para evaluar la formación de colonias arrugada. El primero es el ensayo de punto final, que nos permite observar la arquitectura final, en general 3D, modelado, y el diámetro de una cultura manchada en un punto seleccionado "final" del tiempo. Este enfoque es más útil para la evaluación de las cepas mutantes o condiciones que conducen a defectos dramáticos en la formación de biopelículas. Sin embargo, este método no distingue entre diferencias más sutiles que ocurren en puntos de tiempo antes de que el seleccionado de punto final. Para seguir más de cerca la formación de colonias arrugada, se utiliza un ensayo de evolución en el tiempo, lo que nos permite identificar el inicio de wrinkled la formación de colonias y observar su evolución en el tiempo. Como resultado de este enfoque, las diferencias más sutiles en el momento de la formación de colonias arrugado, arquitectura 3D, y el patrón puede ser identificado. Se utilizó este ensayo curso del tiempo para generar dos semi-cuantitativa de los ensayos de la formación de biopelículas. En primer lugar, el momento en que una cepa comienza a desarrollar una arquitectura 3D puede ser comparada con la de las cepas de control. Hemos encontrado que el retraso en la formación de biopelículas de un mutante particular, en las mismas condiciones es bastante constante 9. Por ejemplo, en los datos mostrados en la figura. 2, el mutante consistentemente exhiben un retraso de 4 horas en la iniciación de la formación de biopelículas. Un segundo semi-cuantitativo medida de la formación de biopelículas es el cambio en el tamaño del diámetro de la colonia arrugado (mancha). Hemos encontrado que el diámetro de las colonias arrugadas progresivamente difiere de la de no-biofilm colonias, alcanzando aproximadamente una diferencia de 2 veces en el punto de tiempo extremo (Fig. 3 </strong>) (Morris y Visick, datos no publicados). Hasta la fecha, no hemos observado un fenotipo sin el otro (es decir, la formación de biopelículas, sin un aumento en el diámetro de las colonias) (datos no publicados), aunque sigue siendo posible que algunos mutantes se comportan de manera diferente. De hecho, se ha informado para V. cholerae que algún resultado colonias arrugada en un aumento sustancial en diámetro de las colonias, mientras que otros no lo hacen 15. Sin embargo, la evaluación del cambio en el diámetro con el tiempo podría ayudar en la caracterización de mutantes biofilm potencial y / o proporcionar una medida cuantitativa adicional de mutantes con retrasos en el desarrollo. De las dos medidas de la formación de biopelículas (tiempo y diámetro), para determinar el inicio de la formación de colonias arrugado es más sensible, pero también más subjetivo, que a la determinación del diámetro de la mancha. Aun así, ambas medidas proporcionan una evaluación semi-cuantitativa de un fenotipo que es extremadamente útil para los investigadores del biofilm, pero no se presta fácilmente a quantification.
Al realizar los ensayos de cultivos de manchas, es importante tener en cuenta las condiciones ambientales en las que las cepas detectadas se cultivan. La formación de colonias arrugada es a menudo influenciado por diversas condiciones ambientales, incluyendo la disponibilidad de nutrientes, temperatura y humedad. Para reducir la variabilidad entre los experimentos, es útil para normalizar estas condiciones tanto como sea posible (es decir, la normalización de las placas de agar a un volumen determinado y el cultivo de las cepas detectadas a una temperatura controlada). Para un mayor control de la variabilidad entre los experimentos de localización, es importante incluir las cepas de control adecuados dentro de cada serie de experimentos. Finalmente, al interpretar los datos de estos ensayos, es necesario realizar ningún experimento un varias veces (3 +), especialmente cuando la evaluación de las diferencias sutiles en la formación de colonias arrugada (por ejemplo, un retraso en la formación de biopelículas o diferencias de modelado). Algunas de las limitaciones de este protocolo son: 1) deterIng. si las células tienen un defecto en el crecimiento puede ser difícil: el crecimiento de células en cultivo líquido no pueden reflejar con precisión las tasas de crecimiento en medios sólidos, y una determinación exacta del crecimiento de las células formadoras de biopelículas, que pueden adherirse entre sí, puede no ser posible; 2) las cepas con defectos de crecimiento será problemático para analizar; 3) puede que no sea posible distinguir las diferencias de diámetro entre las cepas con fenotipos biofilm sutiles; 4) para las cepas que no crecen en un anillo concéntrico puede que no sea posible medir con precisión cambios en el diámetro, 5), mientras que los patrones pueden ser observadas durante la formación de biopelículas, no hay manera de cuantificar el patrón de la biopelícula resultante, y 6) no hay manera de medir la dimensión Z de la biopelícula con este montaje experimental . A pesar de estas limitaciones, sin embargo, este protocolo ofrece un medio para obtener datos numéricos para ayudar a evaluar la formación de colonias arrugada.
En este protocolo, que utilizan una imagen específicasistema (es decir, un microscopio Zeiss disección y ProgRes CapturePRO software de imágenes) para observar y evaluar la formación de colonias arrugada. El sistema de imagen descrito aquí es potente: la capacidad de detectar el inicio de la formación de colonias arrugada, y por lo tanto evaluar el desarrollo con un enfoque curso del tiempo, es mucho mayor a través del uso de un microscopio de disección. Sin embargo, si esta tecnología no está disponible, el protocolo puede ser adaptado para su uso con otros equipos, incluyendo una simple cámara digital con un zoom de enfoque. Si bien este protocolo se centra en la evaluación del desarrollo de colonias arrugada, también podría ser modificado para evaluar la formación de película, una forma de biopelícula que se desarrolla cuando las células están creciendo estáticamente en cultivo líquido. Este protocolo también puede ser útil en la evaluación de otros indicadores de la formación de biopelículas, incluyendo la incorporación de los tintes específicos en las colonias observadas durante el desarrollo del biofilm. Estos incluyen, pero no se limitan a, colorantes tales como Rojo Congo y calcofluo que puede unirse a la celulosa, un componente común de biopelículas bacterianas 16. Además, este protocolo, aunque desarrollado para su uso con V. fischeri, no se limita a este organismo, pero puede generalizarse a estudiar la formación de biopelículas en numerosos organismos diferentes, tales como Bacillus subtilis, 4 Vibrio cholerae 5, Vibrio 6, 7 y Pseudomonas aeruginosa, que toda la formación exhibición colonia arrugada. Finalmente, también se puede adaptar para estudiar otras morfologías de colonia que tienen un patrón de desarrollo, tales como, potencialmente, el patrón que se produce durante el crecimiento de Myxococcus xanthus 17 y desarrollo de la estructura aérea en Pseudomonas aeruginosa 18. Este protocolo es, pues, de uso general para los investigadores de microbiología y la biopelícula.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el SNS R01 GM59690 subvención concedida a KLV.
Name of Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Zeiss | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
CL 1500 EC Cold Light Source | Zeiss | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
Image J | NIH | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |