Muestras de tejido congeladas no fijadas embebidas en un medio de temperatura óptima de corte (OCT) se puede utilizar para estudiar la distribución natural y glicosilación de moco secretado. En este enfoque de procesado de tejido es mínima y la presentación natural de glicolípidos, mucinas y glycan epítopos-se conserva. Las secciones de tejido pueden ser analizadas por inmunohistoquímica usando detección de fluorescencia o cromogénico.
Las mucinas son complejos y fuertemente glicosilada unidos a O glicoproteínas, que contienen más de 70% en peso de carbohidratos 1-3. Mucinas secretadas, producida por las células caliciformes y la mucosa gástrica, el andamio para proporcionar una capa de moco micrómetros de espesor que recubre el epitelio del intestino y el tracto respiratorio 3,4. Además de las mucinas, las capas de moco también contienen péptidos antimicrobianos, citoquinas, y las inmunoglobulinas 5-9. La capa de moco es una parte importante de la inmunidad innata del huésped, y constituye la primera línea de defensa contra los microorganismos invasores 8,10-12. Como tal, el moco está sujeta a numerosas interacciones con microbios, ambos patógenos y simbiontes, y mucinas secretadas forman una interfaz importante para estas interacciones. El estudio de tales interacciones biológicas generalmente implica métodos histológicos para la recogida de tejido y la tinción. Los dos métodos más comúnmente utilizados para la recogida de tejidos histológicos y preserción en la clínica y en los laboratorios de investigación son: la fijación en formol seguido por inclusión en parafina, y la congelación de tejidos, seguido de la incorporación en la crio-protectores de los medios de comunicación.
Embebidos en parafina las muestras de tejido producir secciones con cualidades óptimas para la visualización histológica que incluyen la claridad y la morfología bien definida. Sin embargo, durante el proceso de inclusión en parafina de un número de epítopos se altera y con el fin de estudiar estos epítopos, las secciones de tejido tiene que ser procesado con uno de los muchos métodos de recuperación del epítopo 13. Mucinas secretadas y los lípidos se extraen del tejido durante la etapa de compensación de inclusión en parafina, que requiere prolongar la incubación con solventes orgánicos (xileno o Citrisolv). Por lo tanto, este enfoque es sub-óptimo para estudios centrados en la naturaleza y distribución de las mucinas y moco in vivo.
Por el contrario, los tejidos de congelación en la temperatura óptima de corte (OCT) un medio de inclusiónanula la deshidratación y la limpieza de la muestra, y mantiene la hidratación de la muestra. Esto permite una mejor conservación de la capa de moco hidratado, y por lo tanto permite el estudio de las numerosas funciones de las mucinas en la biología epitelial. Como este método requiere un procesamiento mínimo del tejido, el tejido se conserva en un estado más natural. Por lo tanto congelados secciones tejidos no requieren ningún procesamiento adicional antes de la tinción y pueden ser fácilmente analizados usando métodos de inmunohistoquímica.
Se demuestra la conservación de los micrómetros de espesor capa de mucus secretado en muestras de colon congelados. Esta capa se reduce drásticamente cuando los mismos tejidos se incrustan en parafina. También se demuestra la tinción de inmunofluorescencia de epítopes de glicano presentados en mucinas utilizando lectinas de plantas. La ventaja de este enfoque es que no requiere el uso de fijadores especiales y permite la utilización de tejidos congelados que pueden estar ya conservados en el laboratorio.
La preservación de epítopos de moco y glicano en tejidos congelados es superior a la de los tejidos que se incluyeron en parafina. Hemos demostrado la preservación de la capa de mucosidad secretada (Figuras 1 y 3) y la distribución de las tres estructuras de glicanos (Figura 3) en tejidos congelados en comparación con tejidos incluidos en parafina. Fijadores especializados tales como una solución de Carnoy (60% de etanol, 30% de cloroformo, 10% de ácido acético) 17 se han desarrollado para la conservación óptima de la capa de moco en las muestras de tejido. De manera óptima, esta solución debería ser utilizado para recoger muestras de tejido que están dedicados para los estudios de moco y se muestra para conservar el aspecto liso de la capa de moco 16-17. La capa de moco en las muestras congeladas no fijadas incrustado en octubre aparece rugoso y en algunas zonas puede desprenderse del tejido, sin embargo, el espesor de la capa es en general de acuerdo con la observada en los tejidos que se fijaron con solución de Carnoy y embedded en parafina 16-17. Por ejemplo, la capa de moco congelado en la sección de tejido humano de colon es de ~ 100 m (Figura 1), que se encuentra dentro del rango reportado para Carnoy's fijo muestra colon humano 55,4 ± 2,5 micras (rango de 7,7 a 204,8 m) 16.
Se ha sabido desde hace décadas que los resultados de deshidratación de etanol en ~ 30% la contracción de las muestras biológicas 18, y que los disolventes orgánicos tales como xileno, Citrisolv y lípidos extracto de cloroformo, glucolípidos y, en cierta medida, las proteínas de los tejidos 13. Procesamiento de tejidos para la inclusión en parafina incluye las siguientes etapas: fijación (10% formalina tamponada), deshidratación (aumento de la concentración de etanol) y de compensación (Citrisolv o xileno). Al imitar estos pasos no fijadas sobre secciones de tejido congeladas, hemos demostrado que Citrisolv extrae la mucosidad de las secciones de tejido congeladas resultantes en la morfología del tejido que es similar a la de los tejidos incluidos en parafina (Figure 2, panel derecho). En contraste, la capa de mucus no se alteró por la incubación con formalina o etanol (Figura 2, izquierda y paneles centrales). Esto sugiere que la etapa de compensación de procedimiento estándar de inclusión en parafina, que requiere una incubación prolongada en Citrisolv / xileno, da como resultado el colapso de la capa de moco. La fijación con formalina no daña la capa de moco y secciones de tejidos congelados que fueron fijadas con formalina fácilmente se puede teñir con lectinas y anticuerpos contra glicanos, glicolípidos y proteínas (Figuras 2, 3 y 6). Estos efectos pueden ser insignificantes para el estudio de las proteínas unidas a la membrana y el tejido patología, pero tienen efectos devastadores para las estructuras altamente hidratadas tales como la capa de moco secretado. Sin embargo los estudios histológicos de las mucinas están siendo llevados a cabo con muestras embebidas en parafina, en el que la preservación capa de moco es subóptima. En el análisis en profundidad de la capa de moco composición tal como la identidad exacta de sí mismocreted o unido a la membrana de glicoproteína MUC requieren combinaciones de anticuerpos específicos y espectrometría de masas para la identificación de las cadenas principales de proteínas. La preservación de la capa de moco es más que el primer requisito para dichos estudios.
Muchos laboratorios han muestras de tejidos congelados en OCT que fueron recogidos en el pasado para diferentes proyectos, estos tejidos pueden usarse fácilmente para estudiar las mucinas, glicolípidos y de distribución de glicano que elimina la necesidad de recoger los tejidos en fijadores especiales que están diseñados exclusivamente para la preservación moco. Los tejidos congelados someterse a un procesamiento mínimo y por lo tanto la distribución natural de los glicanos, que son hidratados en la naturaleza, se conserva. Esto es especialmente importante en el campo de las interacciones huésped microbiano. El conocimiento de la distribución y abundancia de naturalista mucinas secretadas y las estructuras de glicanos muchas decorar estas moléculas "barrera" será clave en la comprensión de defensa del huésped, la explotación microbiana y patógenoses.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Nicole M. Nemeth (Universidad de Georgia) y Jeanne M. Fair (LANL) por su ayuda en la recolección de tejidos de pollo, y Steven A. Springer por su ayuda durante el rodaje. El cuidado de las aves en este estudio fue de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud directrices para el uso humano de los animales de laboratorio y todos los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el Comité de Uso de Los Alamos National Security, LLC, operador de Los Alamos Laboratorio Nacional bajo el Contrato No. DE-AC52-06NA25396 con el Departamento de Energía de EE.UU.. El cuidado de los ratones en este estudio está en conformidad con UCSD protocolo animal aprobado. Los tejidos humanos se obtuvieron como parte del protocolo de UCSD IRB aprobado. Este trabajo fue apoyado por la beca 118645 de la Universidad de California Cuota del Programa Laboratorio Presidente (PG) y NS047101 subvención del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Fondo para Microscopía Neurociencia compartido, UC San Diego).
Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
OCT compound | VWR International | 25608-930 |
Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |