目前的诊断药敏试验依靠浮游株生长在营养丰富,有氧条件下的。在这里,我们采用了一种替代人工痰媒介研究的肺囊肿性纤维化的代表都需氧和微需氧条件下绿脓杆菌生物膜药敏。
有越来越多的关注, 在体外药敏试验的相关性应用于体育株时从囊性纤维化(CF)患者的铜绿 。现有的方法依赖于单一或少数菌株生长的需氧和planktonically。预定截止权衡,以确定是否细菌敏感或耐药的任何特定的抗生素1。然而,在慢性肺部感染的CF, 体育绿脓杆菌人口生物膜中存在,并有证据表明,环境主要是微需氧2。在肺和那些在诊断测试中的细菌之间的情况形成了鲜明的差异已成为问题的可靠性,甚至相关的这些测试3。
人工的痰介质(ASM)的体育是一种文化中的CF病人痰的组成部分,包括氨基酸,黏蛋白及游离DNA。 绿脓杆菌</ EM>增长过程中的CF感染,形成自我聚集的生物膜结构和人口的分歧4,5,6,在增长的ASM模仿。本研究的目的是要制定一个酶标板法研究P.药敏绿脓杆菌在ASM,这是适用于微需氧和有氧条件下生长的基础。
一个ASM法在微孔板格式。 体育绿脓杆菌生物膜被允许开发,连续3天在不同浓度的抗菌药物孵化前24小时。生物膜破坏后,细胞活力测定与刃天青染色。此法被用来确定为15个不同的体育妥布霉素柄细胞的最低抑菌浓度(中芯国际)需氧和微需氧的条件下,中芯国际值绿脓杆菌株相比,那些与标准肉汤增长得到。虽然一些证据增加浮游同行相比,他们的成长中的ASM株的MIC值,细菌在微需氧的条件,这表明大大增加抗> 128倍,对妥布霉素,在ASM系统测试时被发现的最大区别相比,在有氧条件下进行检测。
当前药敏试验方法和临床疗效之间缺乏关联3当前方法的有效性提出质疑。几个在体外模型已被用于先前研究体育绿脓杆菌生物膜7,8。然而,这些方法依赖于表面附着生物膜,而ASM生物膜像那些在CF肺9观察。此外,粘液减少氧浓度已经证明,以改变对体育的行为绿脓杆菌 2,影响抗生素的敏感性10。因此如胶似漆Ğ微需氧条件下,ASM可以提供一个更现实的环境中学习药敏。
在这项研究中,我们采用体外模型基于一种新的ASM上复制体育在CF肺4 绿脓杆菌生物膜条件。该模型已成功修改为小规模,高通量检测的抗菌药物。
此法的关键步骤是:
明显的应用是一个小规模的ASM生物膜模型的生物膜抗菌(BSMIC 90) 的敏感性更现实的决心。厌氧和微需氧龛是在目前的CF肺部,并有证据显示,被限制在2生物膜成熟,17深氧气。在这里,我们表明,临床体育 10/14从CF患者痰铜绿假单胞菌株 ASM中的微需氧条件下表现出了相当大(4 – ≥128倍)妥布霉素的敏感性下降。这项研究的结果表明,妥布霉素如抗生素,可能不太对体育的有效绿脓杆菌,比常规药敏试验方法在CF肺部感染。这些结果反映了10生物膜药敏以往的研究。小规模的ASM检测,从而提供一个简单的高通量平台,产生有意义的药敏数据,以更好地告知治疗的决定。该法被限制在以同样的方式作为常规药敏试验,单菌落筛选,可能无法代表整个人口的回升。然而,我们认为,办法(一)使用非表面附着生物膜的生长和(二)适用于微需氧条件,代表一个明确的选择和一个潜在的改善现有方法。我们得出这样的结论:该法是一个合适的模型来研究体育绿脓杆菌生物膜人口。在临床上的进一步测试将确定是否生物膜生长的体育基础的抗生素敏感性绿脓杆菌可能导致不同的微生物学和临床疗效与可能改善抗生素的选择。使用经典的生物膜模型的类似调查显示,导致BSMIC值抗生素治疗5,17不同的建议。
此外抗感染药物的有效性测试,ASM系统是一种廉价,动物模型,简单和可重复性的研究,如那些旨在了解体育多元化的替代绿脓杆菌人口。我们已经看到在自然种群广泛的异质性体育绿脓杆菌恢复CF病人痰18,19。在ASM 4(未发表资料)增长过程中,可以观察到类似的表型和基因型多样化,使得它在体外的CF肺部疾病模型的吸引力。 ASM模型相对简单,可以很容易地设计长期适应实验旨在监测P.抗生素或其他压力的影响,例如, 绿脓杆菌人口的分歧。此外,可以种植在其他细菌病原体ASM的。 Fouhy 等。例如,2007年用于ASM研究与生物膜形成maltophillia 20。
The authors have nothing to disclose.
我们承认,英国国家健康研究学会,博士Hadwen信托人文研究,英国领先的医学研究慈善机构的资金完全非动物研究技术,以取代动物实验,和威康信托基金会(格兰特089215)的支持。我们也承认,诺华制药公司(英国)有限公司(无限制教育补助金)。
Name of reagent | Company | Catalogue number |
DNA from fish sperm | Sigma-Aldrich | 74782 |
Mucin from porcine stomach, type II | Sigma-Aldrich | M2378 |
L-Alanine | Acros Organics | 102830250 |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 |
L(+)-Asparagine monohydrate | Acros Organics | 175271000 |
L(+)-Aspartic acid | Acros Organics | 105041000 |
L-Cysteine | Sigma-Adrich | 168149 |
L(+)-Glutamic acid | Acros Organics | 156211000 |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 |
Glycine | Acros Organics | 220911000 |
L-Histidine | Sigma-Adrich | H8000 |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 |
L(+)-Lysine monohydrochloride | Acros Organics | 125222500 |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625 |
L-Phenylalanine | Acros Organics | 130310250 |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 |
L-Serine | Acros Organics | 132660250 |
L-Threonine | Acros Organics | 138930250 |
L(-)-Tryptophan | Acros Organics | 140590250 |
L-Tyrosine | Acros Organics | 140641000 |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500 |
Diethylenetriaminepentaacetic acid | Sigma-Aldrich | 32318 |
NaCl | Fisher Scientific | S/3160/60 |
KCl | BDH | BDH0258 |
KOH | BDH | BDH0262 |
Egg yolk emulsion | Sigma-Aldrich | 17148 |
ME 2 diaphragm vacuum pump | Vacuubrand | 696126 |
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) | Millipore | SCGPT10RE |
Luria-Bertani medium | Sigma | L2897 |
96-well microtitre plates | Sarstedt | 82.1581 |
24-well tissue culture-treated plates | Iwaki | 3820-024 |
CampyGen gas generation packs | Oxoid | CN0025 |
Microaerophilic chamber | Oxoid | HP0011 |
Tobramycin sulphate | Sigma-Aldrich | T1783 |
Cellulase, from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | 22178 |
Resazurin | Sigma-Aldrich | 199303 |
Citrate.H20 | BDH | BDH0288 |
Fluostar omega microplate reader | BMG-Labtech | SPECTROstar Omega |