Hücresel prion proteini yeni bir tür (PrP<sup> C</sup>) Son zamanlarda burada açıklanan yöntemleri kullanarak bulaşmamış insan beyni saptanmıştır. Bunların bazıları, aynı zamanda, insan beyninden diğer katlanan protein büyüklükler izole yararlıdırlar Bu yöntemler, çeşitli PrP tür izole etmek için de kullanılabilir.
Prion hastalıklarının patogenezinde merkezi bir olay, onun patojenik izoformu PrP Sc 1 içine konak-kodlanmış hücresel prion proteini PrP C bir dönüşüm içerir. PrP-Sc deterjan çözünmez agregaları ve PK 2-6 karşı kısmen dirençlidir ise PrP C, deterjan çözünebilen ve proteinaz K (PK)-sindirim duyarlıdır. PrP Sc PrP C dönüştürme protein β-tabaka yapıları α-sarmal bir konformasyon geçiş dahil olduğu bilinmektedir. Ancak, in vivo yolu içinde çok az anlaşılmıştır. Bir geçici endojen PrP Sc, ara PrP * veya "sessiz prion", bulaşmamış beyin 7 tespit edilmesi henüz.
Biyofiziksel ve biyokimyasal yaklaşımların bir arada kullanarak, bulaşmamış memeli beyin ve nöronal kültürlü gelen çözünmez PrP C agrega (belirlenmiş iPrP C) tespithücreler 8, 9. Burada, deterjan tampon, sukroz adım degrade sedimantasyon, boyut dışlama kromatografisi, özellikle yapısal değişmiş PrP formları, 10 ve PK-tedavi bağlamak gen 5 proteini (G5p) tarafından iPrP zenginleşmesine Ultrasantrifügasyon dahil olmak üzere bu yöntemlerin ayrıntılı prosedürleri açıklar. Bu yaklaşımların birleşimi çözünmeyen PrP Sc ve PrP C büyüklükler değil, aynı zamanda normal insan beyninden çözünür PrP C oligomerler sadece ayırır. Protokolleri enfekte beyinleri ve enfekte olmayan beyninden iPrP C PrP Sc hem izole etmek için kullanılan oylandı Burada açıklanan bu yana, fizikokimyasal özellikleri, nörotoksisite ve iki izoformu arasındaki enfektivite farklılıkları karşılaştırmak için bir fırsat verin. Böyle bir çalışmanın büyük ölçüde bulaşıcı proteinli patojenlerin anlayışımızı geliştirecektir. IPrP C fizyolojisi ve patofizyolojisi halen belirsizdir. Özellikle, yeni-idyazısından İnsan prion hastalığı proteaz duyarlı prionopathy değişken olarak adlandırılan, biz iPrP C 11, 12 ile immunoreaktif davranış ve parçalanma paylaşan yeni PrP Sc bulundu. Ayrıca, biz son zamanlarda iPrP C Alzheimer hastalığı 13 amiloid-β proteini ile etkileşime ana tür olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada, bu yöntemlerin diğer nörodejeneratif bozukluklar ile ilgili olmayan prion proteininin agregalar için uygulama düşündüren, Alzheimer hastalığının 13 Abeta agrega ve oligomerler izole etmek için kullanılmıştır.
Burada bildirilen yaklaşımların birleşimi normal insan beyninin sürekli çözünmez PrP C agrega ve çözünür PrP C oligomerler ayırır. Bir saat boyunca 100,000 x g'da santrifüjü gibi geniş ölçüde çözünür PrP C den 14 çözünmez PrP Sc ayrılması için kullanılmış olan klasik bir yöntemdir. Bu, uyarılar bir etkili olsa da santrifüj sonrasında (S2) süpernatant çekme sırasında kirlenmesini önlemek içindir. IPrP C jel pr…
The authors have nothing to disclose.
yazarlar normal beyin numuneleri sağlamak için İnsan Beyin ve Omurilik Sıvısı Kaynak Merkezi (Los Angeles, CA) müteşekkiriz. Bu çalışma McGregor Vakfı'nın desteği ve Cumhurbaşkanı İhtiyari Fonu (Case Western Reserve Üniversitesi) ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01NS062787, CJD Vakfı, İttifak BioSecure yanı sıra Üniversite Yaşlanma Merkezi ve Sağlık tarafından desteklenen .
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |