Summary

Monositler ve İnsan Kan Küçük Örneklerden Dendritik Hücrelerde Lineage özgü Toll-like reseptör-aracılı Sinyali Kantitatif Görüntüleme

Published: April 16, 2012
doi:

Summary

Biz (ImageStream teknolojinin kullanıldığını anlatmak<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Hangi iyi tanımlanmış hasta kohortlarında primer immün hücrelerinin hücresel mekanizmaları ölçmek için, aynı anda yüksek-çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştirir. Çalışmalarımız konu kohortlarında küçük örneklerde soyunun spesifik hücresel tepkileri ölçmek için translasyonel araştırmalar için bir plan sunar.

Abstract

Bağışıklık durumu bireysel farklılıkları enfeksiyona yanıtların saptanması ve hastalığın ciddiyeti ve sonuçları katkıda bulunmaktadır. Yaşlanma viral ve bakteriyel enfeksiyonlara karşı artmış duyarlılık ile ilişkili ve humoral iyi belgelenmiş düşüşün yanı sıra hücre-aracılı bağışıklık yanıtı 1,2 ile aşılara yanıt azalır. Biz son zamanlarda Toll benzeri reseptörler (TLR), mikrobiyal enfeksiyon ve tetik antimikrobiyal konak savunma yanıtları 3 algılamak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kilit bileşenleri üzerindeki yaşlanma etkilerini değerlendirdik. Sağlıklı insan donör büyük bir kohort, biz yaşlılar o periferik kan monosit ifade ve belli TLR 4 ve dendritik hücreler benzer düşük TLR düzeyleri ve sinyalizasyon yanıtları (DC) fonksiyonu azalmış gösterdi, hayati önem taşıyor hücreler antijen sunan doğal ve kazanılmış bağışıklık 5 arasındaki bağlantı. Biz bir makrofajlarda TLR3 bozulmasına göstermiştirBatı Nil virüsü 6,7 enfeksiyonuna yanıt olarak yaşlı donörlerden DC'lerin IFN d düşük üretim.

Immunosenescence anlayışımıza ve terapötik müdahale Paramount yanıt spesifik hücre tiplerinin ayrıntılı bir anlayış ve sinyal iletim mekanizması (s). FACS veya immunoblotting tarafından birincil hücre ve hücre ölçme belirteçlerin görüntüleme yoluyla bağışıklık yanıtları Geleneksel çalışmaları Ancak, bu çalışmalar genellikle hastalar mevcut küçük bir örnek hacmi ve birden çok karmaşık laboratuvar teknikleri yapmak yetersizlik teknik sınırlıdır, önemli ölçüde bizim anlayış gelişmiş var insan örnekleri. ImageStream eş zamanlı yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme ile kantitatif akım sitometri birleştiriyor ve böylece hasta duyarlılığının etkin bir şekilde yakalamak için eş zamanlı birden fazla hücre popülasyonlarının araştırılması kolaylaştırır. Burada DC'ler içinde ImageStream kullanımını değerlendirmek için göstermek TLR7 / 8fosforilasyon ve immün yanıtı 8 için kritik olan çok sayıda gen transkripsiyonu başlatan önemli bir transkripsiyon faktörü NF-KB, nükleer translokasyonu aktivasyon aracılı artar. Biz de son zamanlarda TLR5 sinyalizasyon ve 9 yaşlanma değişmiş immün yanıt katkıda bulunabilir yaşlı donörlerden monositlerde NF-KB yolunun daha önceden tanınmayan değişiklik gösterdiği, bu teknoloji kullanma.

Protocol

1. Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve uyarılması Yerel Kurumsal Değerlendirme Kurulu kuralları uyarınca yazılı onam sonra sağlıklı gönüllülerden alınan 10-50 ml heparinize kan edinin. Yaşlanma veya hastalık çalışmalar için her bir gönüllü veya hasta için patogenezi, etme ve dışlama kriterleri açıkça belirlenmelidir. CPT tüpler veya Ficoll-Paque kullanarak Plus, izolasyon 7 (Reaktifler, Tablo 1) gününde üreticinin talimatlarına (GE H…

Discussion

Translasyonel çalışmalar ImageStream kullanımında önemli adımlar uygun karşılaştırma grupları ve optimizasyonu ve antikor özgüllük doğrulama seçimi vardır. Etiketli hedef konu grupları arasındaki farklar histogramlar ve hücre görüntüler arasında kolayca belli olacak. Ilgili reseptörler ve sinyal yolları değişikliklerin ayrıntılı bir analiz ile birlikte, bu veriler özel kohortlarında bağışıklık bozukluğunun altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayacaktır. Te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089.992 ve NCRR / GCRC Programı M01-RR00125) tarafından kısmen desteklenmiştir. Yazarlar, herhangi bir rekabet mali çıkarlarının beyan ve Dr Mark Shlomchik, Yale Hücre Sıralayıcısı Çekirdek Tesis müdürü teşekkür ederim.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
R848 Invivogen tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
BD Perm/Wash BD Biosciences 554723
CD14-PE eBioscience 12-0149-41
CD4-PacBlue BD Pharmingen 68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC BD Biosciences 340546
CD11c-PE BD Biosciences 347637
CD123-PE BD Biosciences 340545
rabbit anti-NF-κB (p65) SantaCruz SC-372
Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Invitrogen A21246
DAPI Invitrogen D21490
ImageStream X Amnis  

Table 1. Specific reagents and equipment.

Cell type FITC PE Alexa 647 PacBlue
Monocyte   CD14 NF-κB (p65)  
mDC Lin1 CD11c NF-κB (p65) CD4
pDC Lin1 CD123 NF-κB (p65) CD4

Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways

Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.

References

  1. Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
  2. Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
  3. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
  4. van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
  5. Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
  6. Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
  7. Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
  8. Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
  9. Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
  10. George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).

Play Video

Cite This Article
Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741, doi:10.3791/3741 (2012).

View Video