Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time ingeschakeld<em> In</em> Situ beeldvorming van levende weefsels in diermodellen, en zodoende het ons vermogen om cellulaire gedrag te onderzoeken, zowel in fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier hebben we een overzicht van de voorbereidingen die vereist zijn om intravitale beeldvorming van de muis popliteale lymfeklieren uit te voeren.
Lymfeklieren (LNS) zijn secundaire lymfoïde organen, die strategisch liggen verspreid over het lichaam toe te staan voor het vangen en presentatie van vreemde antigenen van perifere weefsels naar de adaptieve immuunrespons te vullen. Naast elkaar tussen de aangeboren en adaptieve immuunreacties, de LN is een ideale plaats om immuun cel interacties 1,2 bestuderen. Lymfocyten (T-cellen, B-cellen en NK-cellen), dendritische cellen (DC) en macrofagen omvatten de bulk van beenmerg-afgeleide cellulaire elementen van het LN. Deze cellen zijn strategisch gepositioneerd in het LN om een efficiënte bewaking van de eigen antigenen en potentiële buitenlandse antigenen 3-5 mogelijk te maken. Het proces waarbij lymfocyten succes tegenkomen verwante antigenen is een onderwerp van intens onderzoek in de afgelopen jaren, en het gaat om een integratie van moleculaire contacten met inbegrip van antigeen-receptoren, adhesiemoleculen, chemokines, en stromale structuren zoals de fibro-reticulair netwerk 2,6-12 . </p>
Voorafgaand aan de ontwikkeling van hoge-resolutie real-time in vivo fluorescentie beeldvorming, onderzoekers zich op statische beeldvorming, die biedt alleen antwoorden met betrekking tot morfologie, positie en architectuur. Hoewel deze vragen zijn van fundamenteel belang in ons begrip van het immuunsysteem van cel gedrag, heeft de beperkingen die inherent zijn met deze techniek niet toe analyse te ontcijferen lymfocyten mensenhandel en milieu aanwijzingen dat dynamische cel gedrag beïnvloeden. Onlangs heeft de ontwikkeling van intravitale twee-foton laser scanning microscopie (2P-LSM) heeft het mogelijk gemaakt de onderzoekers om de dynamische bewegingen en interacties van individuele cellen te bekijken binnen de live-LNS in situ 12-16. In het bijzonder, hebben wij en anderen gebruikt een techniek die afbeelding cellulaire gedrag en interacties binnen de knieholte LN, waar de compacte, dichte natuur in het voordeel van multiplex data-acquisitie biedt over een groot weefsel gebied met diverse weefsel sub-structuren 11,17-18 . Het iis belangrijk op te merken dat deze techniek extra voordelen ten opzichte van geëxplanteerd tissue imaging technieken, die verstoring van bloed, lymfe stroom, en uiteindelijk de cellulaire dynamiek van het systeem nodig heeft. Daarnaast geëxplanteerd weefsels hebben een zeer beperkt venster van de tijd waarin het weefsel blijft levensvatbaar voor de beeldvorming na explant. Met de juiste hydratatie en bewaking van het milieu van het dier omstandigheden kan de beeldvorming tijd aanzienlijk uit te breiden met deze intravitale techniek. Hier presenteren we een gedetailleerde methode voor het bereiden muis knieholte LN voor het verrichten van intravitale beeldvorming.
Recente ontwikkelingen in de hoge-resolutie in situ beeldvormende technieken, in het bijzonder 2P-LSM, gingen gepaard met een groeiende interesse in de studie van dynamische cellulaire gedrag in vivo. De 4D beeldverwerking techniek op de knieholte LN van een levende muis kunnen dergelijke analyses in het dynamisch gedrag van de immuuncellen in het ongestoorde weefsel micro-omgeving. Het gebruik van 2P-LSM met meerdere detectoren verspreid over het hele zichtbare spectrum maakt simultane beeldvorming het verzamelen van gegevens van meerdere celpopulaties. Dit kan nu worden bereikt door het gebruik van in vivo celspecifieke fluorescerende reporter muizen (bijv. ubiquitine-EGFP,-RFP of-eCFP) gecombineerd met het gebruik van adoptieve overdracht van differentieel gelabelde celpopulaties met organische fluorescente cellen kleurstoffen (bijv. CFSE , Snarf-1 en Cell Tracker Oranje) om cellulaire mechanismen en de functie te onderzoeken binnen de LN. Naast de directe waarneming van interacties tussen differentieel gevolgd cell populaties de multiplex imaging dataset verder analyse ondergaan met in de handel verkrijgbaar beeldverwerkingssysteem software programma's (bijvoorbeeld Imaris, Inc BitPlane) verder te ontrafelen cel gedrag en functie. Een breed scala aan mogelijkheden bestaan om te studeren cellulaire interactie mechanismen met behulp van deze in vivo en in silico technieken.
De belangrijkste beperking van de experimentele benadering hier beschreven de technische complexiteit inherent aan de operatie benadering. Deze techniek vergt zware training om vertrouwd te raken met de relevante anatomie en de precieze technische procedures en vaardigheden zoals vereist door dit protocol. Verdere complicerende factoren zijn onder meer de moeilijkheid bij het minimaliseren van weefselschade tijdens LN exploratie, het optimaliseren van weefsel stabiliteit tijdens beeldvorming, en het voorkomen van thermische en laser letsel aan de LN voor en tijdens de beeldvorming experimenteren. Storing van een van deze factoren zal resulteren in minder-dan-optimale lymfeocyte beweeglijkheid en zal daarom de correcte interpretatie van de resulterende imaging data-analyses.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick's Foundation, Dana Foundation, Gabrielle's Angel Foundation, en Hyundai Motors van Amerika "Hope-on-Wheels"-programma.
Reagent | Company | Catalogue Number |
Isoflurane, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-773-60 |
Vetbond | 3M | 1469SB |
Nair – hair removal lotion | Nair | |
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV |
Heating pad | Watlow | |
Heating Pad Controller | Watlow | |
Air and O2 | Airgas | |
Temperature probe | Harvard Apparatus | |
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc | 14101 |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc | 14141 |
Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5880 |
Cover of 100×20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 |
Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-150-08 |